組織學/免疫細胞化學術

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組織學

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免疫細胞化學（immunocytochemistry）術是應用抗原與抗體結合的免疫學原理，檢測細胞內多肽、蛋白質及膜表面抗原和受體等大分子物質的存在與分布。這種方法特異性強，敏感度高，進展迅速，應用廣泛，成為生物學和醫學眾多學科的重要研究手段。近年隨著純化抗原和制備單克隆抗體的廣泛開展以及標記技術不斷提高，免疫細胞化學的進展更是日新月異，不僅用于許多基本理論的研究，并取得重大突破，而且也用于疾病的早期快速診斷等臨床實際。組織的多肽和蛋白質種類繁多，具有抗原性。分離純化人或動物組織某種蛋白質，作為抗原注入另一種動物體內，后者即產生相應的特異性抗體（免疫球蛋白）。從被免疫動物的血清中提取出該抗體，再以熒光素、酶、鐵蛋白或膠體金標記，用這種標記抗體處理組織切片或細胞，標記抗體即與細胞的相應蛋白質（抗原）發生特異性結合（圖1-4)。常用的熒光素是異硫氰酸熒光素（FITC)和四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC），在熒光顯微鏡下可觀察熒光抗體抗原復合物（圖1－5）。常用的酶是辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP,從辣根菜中提取的），它的底物是3，3^'－二氨基、聯苯胺（DAB）和H₂O₂,HRP使DAB氧化形成棕黃色產物，可在光鏡和電鏡下觀察（圖1－6）。鐵蛋白和膠體金標記抗體與抗原的結合，也可在光鏡和電鏡下觀察（圖1－7）。

大鼠腺垂體免疫組織化學（PAS法）示生長激素細胞

圖1－6 大鼠腺垂體免疫組織化學（PAS法）示生長激素細胞

（上海醫科大趙培林教授供圖）

免疫細胞化學（蛋白A-膠體金法）和原位雜交術示大鼠垂體

圖1-7 免疫細胞化學（蛋白A-膠體金法）和原位雜交術示大鼠垂體

催乳素細胞電鏡像 N催乳素細胞核

↑分泌顆粒內顯示金粒

粗面內質網（RER）顯示銀粒

（加拿大Douglas醫院研究中心童毅愛博士贈圖）

標記抗體民被檢抗原的結合方式有兩種。一是直接法，即如上述用標記抗體與樣品中的抗原直接結合（圖1－8）。這種方法操作簡便，但敏感度不及間接法。間接法是將分離的抗體（第一抗體簡稱一抗）再作為抗原免疫另一種動物，制備該抗體（抗原）的抗體（第二抗體簡稱二抗），再以標記物標記二抗。先后以一抗和標記二抗處理樣品，最終形成抗原一抗－標記二抗復合物（圖1－8）。間接法中的一個抗原分子可通過一抗與多個標記二抗相結合，因此它的敏感度較高，而且目前國內外均有多種標記二抗商品供應，使用方便。間接法中較常用的是一種稱之為過氧化物酶－抗過氧化物酶復合物法（peroxidase-antiperoxidase complexmethod,PAS法），該法除需一抗和二抗外，還需制備HRP標記的抗酶抗體，即以HRP作為抗原免疫動物，制成抗HRP抗體，再以HRP標記該抗體制成由3個酶分子與2個抗酶抗體組成的相當穩定的環形PAP復合物。標本先后以一抗、二抗和PAP復合物處理后，再以DAB顯色，即可檢測抗原的分布。此法由于細胞內的抗原通過抗體的層層放大而與多個酶分子結合，因此敏感性很強（圖1－9）。

免疫細胞化學直接法（A）與間接法（B）示意圖

圖1－8 免疫細胞化學直接法（A）與間接法（B）示意圖

免疫細胞化學PAP法示意圖

圖1－9 免疫細胞化學PAP法示意圖

免疫細胞化學術近10年來又有新進展，如生物素－親合素等新穎試劑的應用，為檢測微量抗原、受體、抗體開辟了新途徑。生物素（biotin）又稱維生素H，是從卵黃和肝中提取的一種小分子物質（分子量244.31）；親合素（avidin）又稱卵白素，是從卵白中提取的一種糖蛋白（分子量68kD）。每個親合素分子有生物素結合的4個位點，二者可牢固結合成不可逆的復合物。生物素－親合素的應用大致有三種方法。①標記親合素－生物素法（labelled avidin- biotin method,LAB法）：將親合素與標記物（HRP）結合，一個親合素可結合多個HRP；將生物素與抗體（一抗與二抗）結合，一個抗體分子可連接多個生物素分子，抗體的活性不受影響。細胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結合，繼而將標記親合素結合在抗體的生物素上，如此多層放大提高了檢測抗原的敏感性（圖1－10）。②橋連親合素－生物素法（bridged avidin-biotin method,BAB法)：先使抗原與生物素化的抗體結合，再以游離親合素將生物素化的抗體與酶標生物素搭橋連接，也達到多層放大效果（圖1－10）。③親合素－生物素－過氧化物酶復合物法（avidin-biotin-peroxidase complexmethod,ABC法）；此法是前兩種方法的改進，即先按一定比例將親合素與酶標生物素結合在一起，形成親合素－生物素－過氧化物酶復合物（ABC復合物），標本中的抗原先后與一抗、生物素化二抗、ABC復合物結合，最終形成晶格樣結構的復合體，其中網絡了大量酶分子，從而大大提高了檢測抗原的靈敏度（圖1－10）。現有配制現成的ABC藥盒商品供應，操作簡便，是目前廣泛應用的一種方法。

生物素－親合素免疫細胞化學示意圖