生物化學(xué)與分子生物學(xué)/質(zhì)粒載體

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生物化學(xué)與分子生物學(xué)

DNA重組與基因工程
- 基因工程載體
  - 質(zhì)粒載體
  - 噬菌體載體
  - 動物病毒載體

質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌或細(xì)胞染色質(zhì)以外的，能自主復(fù)制的，與細(xì)菌或細(xì)胞共生的遺傳成分。其特點(diǎn)如下：

①是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA（covalentlyclosed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。

②能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）。一般質(zhì)粒DNA復(fù)制的質(zhì)粒可隨宿主細(xì)胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴(yán)緊控制（stringent control）型質(zhì)粒的復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到十幾個(gè)拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control）型質(zhì)粒，其復(fù)制宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。每個(gè)質(zhì)粒DNA上都有復(fù)制的起點(diǎn)，只有ori能被宿主細(xì)胞復(fù)制蛋白質(zhì)識別的質(zhì)粒才能在該種細(xì)胞中復(fù)制，不同質(zhì)粒復(fù)制控制狀況主要與復(fù)制起點(diǎn)的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細(xì)胞染色質(zhì)DNA中，隨宿主DNA復(fù)制，稱為附加體，例如細(xì)菌的性質(zhì)粒就是一種附加體，它可以質(zhì)粒形式存在，也能整合入細(xì)菌的DNA，又能從細(xì)菌染色質(zhì)DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩個(gè)細(xì)菌間形成纖毛狀細(xì)管連接的接合（conjugation），通過這細(xì)管遺傳物質(zhì)可在兩個(gè)細(xì)菌間傳遞。

③質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。這點(diǎn)不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨(dú)立復(fù)制的調(diào)控，但線粒體的功能是細(xì)胞生存所必需的。線粒體是細(xì)胞的一部分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細(xì)胞的特定條件下生存，例如，細(xì)菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細(xì)菌就能在相應(yīng)的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對宿主不是寄生的，而是共生的。醫(yī)學(xué)上遇到許多細(xì)菌的抗藥性，常與R質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳播有關(guān)，F(xiàn)質(zhì)粒就能促使這種傳遞。

pBR322及pUC18圖譜

圖20-2　pBR322及pUC18圖譜

現(xiàn)在分子生物學(xué)使用的質(zhì)粒載體都已不是原來細(xì)菌或細(xì)胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過了許多的人工的改造。從不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康某霭l(fā)，人們設(shè)計(jì)了各種不同的類型的質(zhì)粒載體，近年來發(fā)展很快，新的有特定用途的質(zhì)粒不斷被創(chuàng)建。圖20-2給出最常用的大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC19的圖譜，此質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)處序列經(jīng)過改造，能高頻率起動質(zhì)粒復(fù)制，使一個(gè)細(xì)菌pUC19的拷貝數(shù)可達(dá)500-700個(gè)；質(zhì)粒攜帶一個(gè)抗氨芐青霉素基因，編碼能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而被壞氨芐青霉素的酶，當(dāng)用pUC19轉(zhuǎn)化細(xì)菌后放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，凡不含pUC19者都不能生長，結(jié)果長出的細(xì)菌就是都含有pUC19的；pUC19還攜帶細(xì)菌lac操縱元中的lacI和lacZ基因編碼，β-半乳糖苷酶N端狀146個(gè)氨基酸的段落，當(dāng)培養(yǎng)基中含有誘導(dǎo)物IPTG和Xgal時(shí)，lacz ' 基因被誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶N端肽與宿主菌表達(dá)的C端肽互補(bǔ)而具有β-半乳糖苷酶活性（質(zhì)粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶活性，稱為α-互補(bǔ)，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色；在lacz '中間又插入了一段人工設(shè)計(jì)合成的DNA序列，其中密集多個(gè)常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點(diǎn)，使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置，當(dāng)外來序列插入后則破壞了lacz '編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，這種顏色標(biāo)志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為藍(lán)白篩選法。