生物化學與分子生物學/噬菌體載體

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生物化學與分子生物學

DNA重組與基因工程
- 基因工程載體
  - 質粒載體
  - 噬菌體載體
  - 動物病毒載體

噬菌體（phage）是感染細菌的一類病毒，有的噬菌體基因組較大，加入λ噬菌和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應用最為廣泛。

λ噬菌體由頭和尾構成，其基因組是長約49kb的線性雙鏈DNA 分子，組裝在頭部蛋白質外殼內部，其序列已被全部測出。λ噬菌體感染時，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質外殼留在菌外。DNA進入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補單鏈粘末端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖（圖20-3）：①溶菌性方式（lyticpathway）：在營養(yǎng)充足，條件適合細菌繁殖時，利用宿主菌中的酶類和原料，λDNA上基因可按調控的順序表達合成構成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質，λDNA經多次復制合成許多子代λDNA，于是裝配成許多子代的λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶原性方式（lysogenic pathway）：進入細菌的λDNA可整合(integrate）入細菌的染色質DNA中，隨細菌染色體DNA復制，傳給細菌后代，這個穩(wěn)定潛伏在細菌染色質DNA中的λDNA稱為原噬菌體(prophage)，含有原噬菌體的細菌稱為溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進入溶菌性方式的繁殖。

λ噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式

圖20-3　λ噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式

λ噬菌體整個基因組如圖20-4所示，可分為三個部分，①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質。②中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調控基因和序列、以及λDNA復制起始均在這區(qū)域內。左右臂包含λDNA復制、噬菌體結構蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。

利用λ噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖。現(xiàn)在廣泛使用的λ噬菌體載體也是已作過許多人工改造的，主要的改造是：①設計去除λDNA上的一些限制性酶切點。這是因為λDNA較大，序列中的限制性酶切點過多，妨礙其應用。②在中段非必需區(qū)，替換插入某些標志基因如上述的可供藍白篩選lacI-lacZ’序列，和多克隆位點等。由此可構建出兩類λ噬菌體作載體；一類是插入型載體，可將外來序列插中段，常用的λgt系列載體，一般容許插入5-7kb外來DNA；另一類是轉換型載體，即可用外來DNA替代中段，如IMBL系列載體。

野生型λ噬菌體DNA及相應的λ噬菌體DNA圖譜

圖20-4　野生型λ噬菌體DNA及相應的λ噬菌體DNA圖譜

插入或置換中段外來的DNA長度是有一定限制的，當噬菌體DNA長度大于野生型λ噬菌體基因組105%或小于78%時，包裝而成的噬菌體存活力顯著下降。所以λ噬菌體載體可插入長5-20kb的外來DNA，這比質粒載體能插入的DNA長得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質粒轉化細菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構建cDNA文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質粒載體復雜。

如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質粒的復制序列、標志基因、多克隆位點等，就可構成cos質粒或稱為粘粒的載體。粘粒可插入45kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質粒的形式在細菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構建。