生物化學與分子生物學/克隆基因的表達

跳轉到：導航, 搜索

生物化學與分子生物學

DNA重組與基因工程

使克隆的基因在細胞中表達對理論的研究和實驗的應用都是十分重要的意義的。克隆的基因只有通過表達才能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理，克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白質在醫學上、以至在工業上都是很有應用價值的，可以克隆其基因使之在宿主細胞中大量表達而獲得。要使克隆基因在宿主細胞中表達，就要將它放入帶有基因表達所需要的各種組件的載體中，這種載體就稱為表達載體（expression vector）。克隆基因可以放在不同的宿主細胞中表達，可用大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細胞、培養的哺乳類動物細胞、以至整體動物。對不同的表達系統，需要構建不同的表達載體。克隆基因在不同的系統中表達成功的把握性，取決于我們對這些系統中基因表達調控規律的認識程度。

幾種常用的大腸桿菌表達載體

圖20-11　幾種常用的大腸桿菌表達載體

人類對大腸桿菌經過長期的研究，對其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養操作簡單、生長繁殖快、價格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達工具已有二十多年的經驗積累，大腸桿菌表達外源基因產物的水平遠高于其它基因表達系統，表達的目的蛋白量甚至能超過細菌總蛋白量的80%。因此大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統。設計外源基因在大腸桿菌表達就需要外源基因在大腸桿菌中表達所需要的元件，包括轉錄起始必需的啟動子、翻譯起始所必需的核糖體識別序列等；外源基因表達的產物可能會對大腸桿菌有毒害作用，會影響細菌的生存繁殖，所以大多數表達載體都帶有誘導性表達所需要的元件，即有操縱子序列以及與之配套的調控基因等；外源基因還應當插入到適合于表達的位置，所以表達載體中要設有適合的多克隆位點；此外還應具備基因克隆篩選的條件，包括在細胞中復制必需的復制起始序列、篩選標志如抗藥性基因等。圖20-12中繪出幾種常用的表達載體例子。pBV220是我國科學工用者自己構建的表達載體，使用了很強的PRPL雙啟動子，含有編碼溫度敏感性阻遏蛋白的cI857基因，在30-32℃時產生的阻遏蛋白能阻止PRPL的轉錄起始，細菌可以正常生長繁殖，42攝氏度時該阻遏蛋白發生構像變化而失活，基因開始轉錄而表達。

真核表達載體pSV2-neo

圖20-12　真核表達載體pSV2-neo

當要將真核基因放入原核細胞中表達產生蛋白質時，原核系統就表現出許多缺陷：①沒有真核轉錄后加工的功能，不能進行mRNA的剪接，所以只能表達cDNA而不能表達真核的基因組基因；②沒有真核翻譯后加工的功能，表達產生的蛋白質，不能進行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對和空間構像折疊，因而產生的蛋白質常沒有足夠的生物學活性；③表達的蛋白質經常是不溶的，會在細菌內聚集成包涵體（inclusiion body），尤其當表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質合成快速太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導致疏水基因外露等。細菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無生物活性的不溶性蛋白，要經過復性（renaturation），使其重新散開、重新折疊成具有天然蛋白構象和良好生物活性的蛋白質，常常是一件很困難的事情。也可以設計載體使大腸桿菌分泌表達出可溶性目的蛋白，但表達量往往不高。

要表達真核生物的蛋白質，采用真核表達系統自然應比原核系統優越，常用的酵母、昆蟲、動物和哺乳類細胞等表達系統。真核表達載體至少要含兩類序列：①原核質粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復制起始序列、能用在細菌中篩選克隆的抗藥性基因標志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復制繁殖得到足夠使用的數量。②在真核宿主細胞中表達重組基因所需要的元件，包括啟動子、增強子、轉錄終止和加poly-A信號序列、mRNA剪接信號序列、能在宿主細胞中復制或增殖的序列，能用在宿主細胞中篩選的標志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內切酶識別位點等。圖20-12舉出一個真核表達載體的例子。