醫(yī)學微生物學/人類免疫缺陷病毒

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醫(yī)學微生物學

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本病毒為愛滋病人（Aids）的病原體，系引起細胞病變的靈長類逆轉(zhuǎn)錄病毒之一，屬逆轉(zhuǎn)錄病科(Retroviridae)慢病毒亞科(Lentivirinae)。它于1983年 Montaginer 等首先從1例淋巴腺病綜合征患者分離到，命名為淋巴腺病綜合征相關(guān)病毒(LymphadenopathyAssociated Virus,LAS) 。隨后1984年國Gallo等從愛滋病人分離到逆轉(zhuǎn)錄病毒，命名為嗜人類T淋巴細胞病毒Ⅲ型(Human T Cell Lymphotropic Virus Type Ⅲ ,HTLV-Ⅲ)，后來證明這二種病毒是一樣的。至1986年國際病毒命名委員統(tǒng)一稱為人類免疫缺陷病毒(Human Immunodificidncy Virus ,HIV) 。HIV主要型別為HIV-1和HIV-2，愛滋病大多由HIV-1引起。

一、生物學診斷

（一）形態(tài)結(jié)構(gòu)

病毒呈球形，直徑100～120nm，電鏡下可見一致密的圓錐狀核心，內(nèi)含病毒RNA 分子和酶（逆轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶），病毒外層囊膜系雙層脂質(zhì)蛋白膜，其中嵌有g(shù)p120和gp41，分別組成刺突和跨膜蛋白。囊膜內(nèi)面為P17蛋白構(gòu)成的衣殼，其內(nèi)有核心蛋白（P24）包裹RNA（圖30-1）。

（二）基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的功能

HIV基因組長約9.2～9.7kb，含gag、Pol、env、3個結(jié)構(gòu)基因，及至少6個調(diào)控基因（Tat Rev、Nef、Vif、VPU、Vpr）并在基因組的5′端和3′端各含長末端序列（圖30-2）。HIVLTR含順式調(diào)控序列，它們控制前病毒基因的表達。已證明在LTR有啟動子和增強子并含負調(diào)控區(qū)。

1．gag基因能編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白（P55），經(jīng)蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。

2．Pol基因編碼聚合酶前體蛋白（P34），經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。

HIV結(jié)構(gòu)示意圖

圖30-1 HIV結(jié)構(gòu)示意圖

HIV基因組結(jié)構(gòu)

圖30-2 HIV基因組結(jié)構(gòu)

3．env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gp120 V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內(nèi)。實驗表明gp41亦有較強抗原性，能誘導產(chǎn)生抗體反應。

4．TaT 基因編碼蛋白（P14）可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進病毒mRNA的翻譯。

5．Rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序(Cis-Actingrepression sequance,Crs) 去抑制作用，增強gag和env基因的表達，以合成相應的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。

6．Nef基因編碼蛋白P27對HIV基因的表達有負調(diào)控作用，以推遲病毒復制。該蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒轉(zhuǎn)錄。可能是HIV在體內(nèi)維持持續(xù)感集體所必需。

7．Vif基因?qū)IV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。

8．VPU基因為HIV-1所特有，對HIV的有效復制及病毒體的裝配與成熟不可少。

9．Vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。

HIV-2基因結(jié)構(gòu)與HIV-1有差別：它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸雜交法檢查HIV-1與HIV-2的核苷酸序列，僅40%相同。env基因表達產(chǎn)物激發(fā)機體產(chǎn)生的抗體無交叉反應。

（三）培養(yǎng)特性

將病人自身外周或骨髓中淋巴細胞經(jīng)PHA刺激48～72小時作體外培養(yǎng)（培養(yǎng)液中加IL2）1～2周后，病毒增殖可釋放至細胞外，并使細胞融合成多核巨細胞，最后細胞破潰死亡。亦可用傳代淋巴細胞系如HT-H9、Molt-4細胞作分離及傳代。

HIV動物感染范圍窄，僅黑猩猩和長劈猿，一般多用黑猩猩做實驗。用感染HIV細胞或無細胞的HIV濾液感染黑猩猩，或?qū)⒏腥綡IV黑猩猩血液輸給正常黑猩猩都感染成功，邊續(xù)8個月在血液和淋巴液中可持續(xù)分離到HIV，在3～5周后查出HIV特異性抗體，并繼續(xù)維持一定水平。但無論黑猩猩或長臂猿感染后都不發(fā)生疾病。

（四）抵抗力

HIV對熱敏感。56℃30min滅活，但在室溫保存7天，仍保持活性。不加穩(wěn)定劑病毒-70℃冰凍失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清中-70℃冰凍3個月仍保持活性。對消毒劑和去污劑亦敏感，0.2%次氯酸鈉0.1%漂白粉，70%乙醇，35%異丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%來蘇爾處理5′能滅活病毒，1%NP-40和0.5%triton-X-100能滅活病毒而保留抗原性。外紫外線、γ射線有較強抵抗力。

二、病毒性與免疫性

（一）傳染源和傳播途徑

HIV感染者是傳染源，曾從血液、精液、陰道分泌液、眼淚、乳汁等分離得HIV。傳播途徑有：

1．性傳播：通過男性同性戀之間及異性間的性接觸感染。

2．血液傳播：通過輸血、血液制品或沒有消毒好的注射器傳播，靜脈嗜毒者共享不經(jīng)消毒的注射器和針頭造成嚴重感染，據(jù)我國云南邊鏡靜脈嗜毒者感染率達60%。

3．母嬰傳播：包括經(jīng)胎盤、產(chǎn)道和哺乳方式傳播。

（二）致病機制

HIV選擇性地侵犯帶有CD4分子的，主要有T4淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等。細胞表面CD4分子是HIV受體，通過HIV囊膜蛋白gp120與細胞膜上CD4結(jié)合后由gp41介導使毒穿入易感細胞內(nèi)，造成細胞破壞。其機制尚未完全清楚，可能通過以下方式起作用：

1．由于HIV包膜蛋白插入細胞或病毒出芽釋放導致細胞膜通透性增加，產(chǎn)生滲透性溶解。

2．受染細胞內(nèi)CD-gp120復合物與細胞器（如高爾基氏體等）的膜融合，使之溶解，導致感染細胞迅速死亡。

3．HIV感染時未整合的DNA積累，或?qū)毎鞍椎囊种疲瑢е翲IV殺傷細胞作用。

4．HIV感染細胞表達的gp120能與未感染細胞膜上的CD4結(jié)合，在gp41作用下融合形成多核巨細胞而溶解死亡。

5．HIV感染細胞膜病毒抗原與特異性抗體結(jié)合，通過激活補體或介導ADCC效應將細胞裂解。

6．HIV誘導自身免疫，如gp41與T4細胞膜上MHCⅡ類分子有一同源區(qū)，由抗gp41抗體可與這類淋巴細胞起交叉反應，導致細胞破壞。

7．細胞程序化死亡（programmedcell death ）：在愛滋病發(fā)病時可激活細胞凋亡 (Apoptosis) 。如HIV的gp120與CD4受體結(jié)合；直接激活受感染的細胞凋亡。甚至感染HIV的T細胞表達的囊膜抗原也可啟動正常T細胞，通過細胞表面CD4分子交聯(lián)間接地引起凋亡CD+4細胞的大量破壞，結(jié)果造成以T4細胞缺損為中心的嚴重免疫缺陷，患者主要表現(xiàn)：外周淋巴細胞減少，T4/T8比例配置，對植物血凝素和某些抗原的反應消失，遲發(fā)型變態(tài)反應下降，NK細胞、巨噬細胞活性減弱，IL2、γ干擾素等細胞因子合成減少。病程早期由于B細胞處于多克隆活化狀態(tài)，患者血清中l(wèi)g水平往往增高，隨著疾病的進展，B細胞對各種抗原產(chǎn)生抗體的功能也直接和間接地受到影響。

愛滋病人由于免疫功能嚴重缺損，常合并嚴重的機會感染，常見的有細胞（鳥分枝桿菌）、原蟲（卡氏肺囊蟲、弓形體）、真菌（白色念珠菌、新型隱球菌）、病毒（巨細胞病毒、單純皰疹病毒，乙型肝炎病毒），最后導致無法控制而死亡，另一些病例可發(fā)生Kaposis肉瘤或惡性淋巴瘤。此外，感染單核巨噬細胞中HIV呈低度增殖，不引起病變，但損害其免疫功能，可將病毒傳播全身，引起間質(zhì)肺炎和亞急性腦炎。

HIV感染人體后，往往經(jīng)歷很長潛伏期（3～5年或更長至8年）才發(fā)病，表明HIV在感染機體中，以潛伏或低水平的慢性感染方式持續(xù)存在。當HIV潛伏細胞受到某些因素刺激，使?jié)摲腍IV激活大量增殖而致病，多數(shù)患者于1-3年內(nèi)為死亡。

（三）免疫性

HIV感染后可刺激機體生產(chǎn)囊膜蛋白（Gp120,Gp41）抗體和核心蛋白（P24）抗體。在HIV攜帶者、愛滋病病人血清中測出低水平的抗病毒中和抗體，其中愛滋病病人水平最低，健康同性戀者最高，說明該抗體在體內(nèi)有保護作用。但抗體不能與單核巨噬細胞內(nèi)存留的病毒接觸，且HIV囊膜蛋白易發(fā)生抗原性變異，原有抗體失去作用，使中和抗體不能發(fā)的應有的作用。在潛伏感染階段，HIV前病毒整合入宿主細胞基因組中，不被免疫系統(tǒng)識別，逃避免疫清除。這些都與HIV引起持續(xù)感染有關(guān)。

三、微生物學診斷

檢測HIV感染者體液中病毒抗原和抗體的方法，操作方便，易于普及應用，其中抗體檢測尤普通。但HIv P24抗原和病毒基因的測定，在HIV感染檢測中的地位和重要性也日益受到重視。

（一）抗體檢測

主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和免疫熒光試驗（IFA）。ELISA用去污劑裂解HIV或感染細胞液提取物作抗原，IFA用感染細胞涂片作抗原進行抗體檢測，如果發(fā)現(xiàn)陽性標本應重復一次。為防止假陽性，可做Westernblot （WB，蛋白印跡法）進一步確證。

WB法是用聚丙烯酰胺凝膠電泳將HIV蛋白進行分離，再經(jīng)傳移電泳將不同蛋白條帶轉(zhuǎn)移于硝酸纖維膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶標抗體染色，就能測出針對不同結(jié)構(gòu)蛋白抗體，如抗gp120、gp41、P24抗體，特異性較高。

(二)抗原檢測

用ELISA檢測P24抗原,在HIV感染早期尚未出現(xiàn)抗體時,血中就有該抗原存在.由于P24量太少,陽性率通常較低。現(xiàn)有用解離免疫復合物法或濃縮P24抗原，來提高敏感性。

（三）核酸檢測

用PCR法檢測HIV基因，具有快速、高效、敏感和特異等優(yōu)點，目前該法已被應用于HIV感染早期診斷及艾滋病的研究中。

（四）病毒分離

常用方法為共培養(yǎng)法，即用正常人外周血液分離單個核細胞，加PHA刺激并培養(yǎng)后，加入病人單個核細胞診斷及艾滋病的研究中。

四、防治原則

自1981年發(fā)現(xiàn)愛滋病，隨后在世界各地迅速蔓延，據(jù)WHO報告，至1995年1月1日全球累積的HIV感染得為2590萬例，愛滋病人850萬例，死亡病人700萬例，其中非洲流行最嚴重，居首位，其次是東南亞地區(qū)。我國于1984年使用美國Ameur公司Ⅷ因子，首次傳入，逐年增加，從1985年至1995年底累HIV感染者3341例，其中117例為愛滋病人，地理分布去最高，占80%左右，以嗜毒者為主。

由于愛滋病驚人的蔓延速度和高度的致死率，已引起WHO和許多國家的重視，普遍采用了一系列綜合措施，主要包括：

（一）廣泛地開展宣傳教育，普及防治知識，認識本病傳染源、傳播方式及悲慘結(jié)局。

（二）建立HIV感染和愛滋病的監(jiān)測系統(tǒng)，掌握流行動態(tài)。對高危人群實行監(jiān)測，嚴格管理愛滋病人及HIV感染者。

（三）對供血者進行HIV抗體檢測，確保輸血和血液制品安全。

（四）加強國境檢疫，防止本病傳入。

特異預防，迄今尚缺理想疫苗。減毒活疫苗和滅活全病毒疫苗，由于難以保證疫苗安全，不宜人體應用。目前選擇基因工程方法研制疫苗，如克隆囊膜蛋白基因、核心蛋白基因，在細胞和動物細胞中表達多肽作亞單位疫苗，或囊膜基因插入病毒或腺病毒中制備重組疫苗。最大問題是囊膜蛋白高度易變性，不同毒株HIVgp120有明顯差別，使疫苗的使用受到了限制。現(xiàn)已證明包膜蛋白gp120的肽鍵中有一些區(qū)段的氨基酸序列比較保守恒定，用該保守恒定片段制備，將能解決問題。

目前用于治療愛滋病的藥物有疊氮脫氧胸苷（AZT）、蘇攔明（Suramin)、雙脫氧胞苷(ddc)、雙脫氧面苷(ddl )等。AZT能干擾病毒DNA合成，從而抑制HIV在體內(nèi)增殖，緩解癥狀，延長病人生存期。蘇拉明對HIV的逆轉(zhuǎn)錄酶活性有抑制作用。ddc是最有效的HIV抑制劑，能明顯減少HIV的復制和改善病人免疫功能。ddl抗病毒的范圍比AZT和ddc 窄一些，但毒性較低，半衰期較長。

此外，發(fā)現(xiàn)許多抑制蛋白酶、阻止HIV與靶細胞結(jié)合或融合的藥物，能分別作用于細胞感染的不同階段，以達到抗HIV的效果，均尚處于研究階段。

中草藥中發(fā)現(xiàn)括蔞蛋白、貝母苷、甘草甜素、及地丁、空心莧、紫草等抽提物有抑HIV的作用。中藥方制治療愛滋病人也能緩解癥狀，都在研究和總結(jié)中。