醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)/基因定位的方法
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基因定位可從家系分析、細(xì)胞、染色體和分子水平進(jìn)行研究，同時(shí)由于使用手段的不同派生出多種方法，不同方法又可聯(lián)合使用，互為補(bǔ)充。現(xiàn)僅就幾個(gè)主要方法加以說(shuō)明。
1．體細(xì)胞雜交法 體細(xì)胞是生物體除生殖細(xì)胞外的所有細(xì)胞。將從身體分離的體細(xì)胞做組織培養(yǎng)進(jìn)行遺傳學(xué)研究的學(xué)科稱為體細(xì)胞遺傳學(xué)（somatic genetics）。體外培養(yǎng)細(xì)胞可人為控制或改變環(huán)境條件，并可建立細(xì)胞株，長(zhǎng)期保存，進(jìn)行各種正常和病理研究。與基因定位有關(guān)的是體細(xì)胞雜交（somatic cell hybridization）。細(xì)胞雜交又稱細(xì)胞融合（cellfusion），是將來(lái)源不同的兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。大多數(shù)體細(xì)胞雜交是用人的細(xì)胞與小鼠、大鼠或倉(cāng)鼠的體細(xì)胞（hybrid cell）進(jìn)行雜交。這種新產(chǎn)生的融合細(xì)胞稱為雜種細(xì)胞（hybridcell)，含有雙親不同的染色體。雜種細(xì)胞有一個(gè)重要的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過(guò)程中出現(xiàn)保留嚙齒類一方染色體而人類染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條，其原因至今不明。這種僅保留少數(shù)甚至一條人染色體的雜種細(xì)胞正是進(jìn)行基因連鎖分析和基因定位的有用材料。由于人和鼠類細(xì)胞都有各自不同的生化和免疫學(xué)特征，Miller等運(yùn)用體細(xì)胞雜交并結(jié)合雜種細(xì)胞的特征，證明雜種細(xì)胞的存活需要胸苷激酶（TK）。但凡含有人第17號(hào)染色體的雜種細(xì)胞都因有TK活性而存活，反之則死亡。從而推斷TK基因定位于第17號(hào)染色體上（圖7－1）。這是首例用細(xì)胞雜交法進(jìn)行的基因定位。由此可見(jiàn)，研究基因定位時(shí)，由于有雜種細(xì)胞這一工具，只需要集中精力于某一條染色體上，就可找到某一基因座位。
7－1 體細(xì)胞雜交基因定位示意圖
2．克隆嵌板法（clone panel method）是應(yīng)用雜種細(xì)胞保留或丟失人染色體有時(shí)有重疊現(xiàn)象而設(shè)計(jì)的一種簡(jiǎn)便有用的基因定位方法。如表7-2所示，選擇3個(gè)都保留有4條人染色體的雜種細(xì)胞克隆，但染色體各不相同。如果某一表型特征只出現(xiàn)于克隆A、C而不見(jiàn)于B，就可決定該特征的基因只能在3號(hào)染色體上，因?yàn)锳、C克隆都有3號(hào)染色體，而B(niǎo)克隆則無(wú)，其它亦可同理判斷這樣3個(gè)克隆可對(duì)8條（23=8）染色體作出判斷；如果是5個(gè)克隆（25=32）就可對(duì)人類22條常染色體和2條性染色體作出判斷。例如半乳糖激酶（GK）、尿苷-磷酸激酶（UMPK）和氨基已糖苷酶A（HEXA）的基因就是用此法分別定位于人的17號(hào)、1號(hào)和15號(hào)染色體上的。此外，還可對(duì)雜種細(xì)胞進(jìn)行特殊染色，來(lái)識(shí)別雜種細(xì)胞中人和鼠染色體，以助基因定位。
表7-2 克隆嵌板示意
| 雜種克隆 | 保留的人染色體 | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
| A | + | + | + | + | - | - | - | - |
| B | + | + | - | - | + | + | - | - |
| C | + | - | + | - | + | - | + | - |
在體細(xì)胞雜交基礎(chǔ)上還發(fā)展了微細(xì)胞（micro cell）技術(shù)，即制備只含少數(shù)或一條人染色體的微細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞雜交。也可將人中期染色體進(jìn)行分離直接轉(zhuǎn)移到鼠類細(xì)胞中，使人染色體在受體細(xì)胞中裂解變成短的DNA片段，并整合到受體細(xì)胞的基因組中。如兩個(gè)基因同時(shí)整合進(jìn)去，就證明它們的緊密連鎖關(guān)系。
3．原位雜交和熒光原位雜交 重組DNA技術(shù)的建立與分子雜交相結(jié)合，從分子水平研究基因定位，發(fā)展了一系列有效方法。例如原位雜交（in situ hybridization）就是分子雜交技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，也是一種直接進(jìn)行基因定位的方法。分子雜交的基本原理是堿基的互補(bǔ)配對(duì)，同源的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈，用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA或RNA分子作為探針，可探測(cè)到細(xì)胞基因組中的同源部分。19770-1978年首次將分子雜交法應(yīng)用于基因定位，即用α及β珠蛋白基因的cDNA為探針，與各種不同的人/鼠雜種細(xì)胞進(jìn)行雜交，再對(duì)DNA雜交情況進(jìn)行分析，找出cDNA探針與人染色DNA順序間的同源互補(bǔ)關(guān)系，從而將人α及β珠蛋白基因分別定位于第16號(hào)和第11號(hào)染色體上。
圖7-2 用原位雜交法將胰島素基因定位于11p15
原位雜交的特點(diǎn)是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色體標(biāo)本上進(jìn)行。所謂原位即指標(biāo)本上DNA原位變性，在利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知核酸探針雜交后，通過(guò)放射自顯影或非放射性檢測(cè)體系來(lái)檢測(cè)染色體上特異DNA或RNA順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)弱來(lái)確定探針的位置，從而進(jìn)行準(zhǔn)確的基因定位。圖7-2表明用此法將胰島素基因定位于11p15。但原位雜交必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行，而在未知致病基因時(shí)，則無(wú)法進(jìn)行基因定位。
放射性同位素標(biāo)記核酸探針與染色體顯帶結(jié)合進(jìn)行原位雜交仍有不少缺點(diǎn)和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊實(shí)驗(yàn)室，自顯影曝光時(shí)間長(zhǎng)，同位素標(biāo)記的探針不易保存，放射污染不利健康，特別是高質(zhì)量的中期染色體標(biāo)本在細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上難以得到，觀察費(fèi)時(shí)，對(duì)間期核的研究難以進(jìn)行等。
熒光原位雜交（florescencein-situ hybridization,FISH）是一種非放射性原位雜交方法。用特殊熒光素標(biāo)記核酸（DNA）探針，可在染色體、細(xì)胞和組織切片標(biāo)本上進(jìn)行DNA雜交，對(duì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是將熒光染料與抗體蛋白結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的分辯率。現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時(shí)進(jìn)行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多色FISH技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，已成為基因定位作圖和醫(yī)學(xué)診斷的重要手段。1992年運(yùn)用這種策略已能在中期染色體和間期細(xì)胞同時(shí)檢測(cè)7個(gè)探針。科學(xué)家們的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)24種不同顏色來(lái)觀察22條常染色體和X、Y染色體。熒光原位雜交法提高了雜交分辯率，可達(dá)100-200kb。此法降低應(yīng)用于基因定位外，還有多種用途，它已日益發(fā)展成為代替常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)的檢測(cè)和診斷方法，在此不多論述。
4．連鎖分析基因 定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。生殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生交換，一對(duì)同源染色體上存在著兩個(gè)相鄰的基因座位，距離較遠(yuǎn)，發(fā)生交換的機(jī)會(huì)較多，則出現(xiàn)基因重組；若兩者較近，重組機(jī)會(huì)較少。重組DNA和分子克隆技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了許多遺傳標(biāo)記——多態(tài)位點(diǎn)，利用某個(gè)擬定位的基因是否與某個(gè)遺傳存在連鎖關(guān)系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體的一定部位，使經(jīng)典連鎖方法獲得新的廣闊用途，成為人類基因定位的重要手段。
染色體上兩個(gè)位點(diǎn)從親代傳給子代時(shí)，若相距1cM，就有1%的重組機(jī)會(huì)。整個(gè)人類基因組含3.2×109bp，相應(yīng)約有3300cM，每個(gè)染色體平均約有150cM，1cM約為1000kb。因此，一個(gè)致病基因和標(biāo)記位點(diǎn)緊密連鎖，二者不須在同一條染色體的同一區(qū)段，一條染色體可以產(chǎn)生大量的DNA多態(tài)，只要提供足夠的家系，按孟德?tīng)柗绞竭z傳的疾病都可將其基因定位。
圖7－3表示某一致病基因與一多態(tài)位點(diǎn)的關(guān)系。父（Ⅰ1）是顯性遺傳病患者，基因型為DN，他妻子（Ⅰ2）正常，基因型為NN，多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)父為Aa,母為AA，在子代中，除Ⅱ4外，都是致病基因與多態(tài)標(biāo)記位點(diǎn)的完全連鎖，即都遺傳了父親的A基因和D基因，或是a基因和正常N基因。據(jù)此信息，就可確證父親的致病基因是多態(tài)標(biāo)記A基因連鎖在同一染色體上，而Ⅱ4則是重組體，而具有標(biāo)記基因A的個(gè)體并不都是患者，Ⅰ2就是這樣，所以，在連鎖分析中，多態(tài)標(biāo)記是極為有用的。
圖7-3 致病基因與標(biāo)記位點(diǎn)的邊鎖關(guān)系圖
在人類基因組中還存在約50000－100000個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列家族，它們均勻穿插于基因組，平均50kb有一個(gè)，這些都是很好地遺傳標(biāo)記對(duì)突變的檢測(cè)和基因定位研究起了重要作用。正如本章開(kāi)始提到，至1993年10月已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多態(tài)標(biāo)記總數(shù)為5964個(gè)，從分子水平進(jìn)行基因定位，還有不少有效的新技術(shù)，它們相互配合使用，使基因定位得到迅速發(fā)展。此外，利用染色體自身結(jié)構(gòu)及染色體畸變法進(jìn)行缺失作圖和基因劑量法等。總之，人們已不只是用單一技術(shù)進(jìn)行基因定位，而是將細(xì)胞、染色體和分子水平技術(shù)結(jié)合起來(lái)，綜合分析，互相印證，以達(dá)快速、準(zhǔn)確的目的。
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