臨床生物化學(xué)/酶活性的濃度單位

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臨床生物化學(xué)

血清酶定量的檢測技術(shù)
- 測定酶活性濃度的兩大類方法
  - 固定時間法（取樣法）
  - 連續(xù)監(jiān)測法與反應(yīng)進(jìn)程的分析
  - 連續(xù)監(jiān)測法測酶活性濃度
  - 酶活性的濃度單位
  - 連續(xù)監(jiān)測法中的干擾因素及其控制

50年代以前酶活性濃度單位的命名混亂，常以方法提出者的姓氏來命名，例如淀粉酶的Somogyi單位，堿性磷酸酶的King單位等等，定義參差不齊，給臨床醫(yī)師帶來很大不便，尤其在建立“連續(xù)監(jiān)測法”測酶后，大量酶應(yīng)用于臨床，此混亂現(xiàn)象更為突出。1963年國際生化協(xié)會通過廣泛討論，提出一個國際單位定義來表示酶量的多少，即1分鐘能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（μmolmin^－1）的酶量為一個國際單位，以IU表示之，由于意見不一致，至今尚未指定酶反應(yīng)溫度，而同一量的酶，在不同溫度時間為1分鐘所轉(zhuǎn)化底物的量將有明顯差異。為避免臨床上誤認(rèn)為只要是同一國際單位的酶量在國際上無論何處所測結(jié)果都應(yīng)一致，目前大多數(shù)實驗工作者常省略國際二字（簡寫也由IU改為U）。

臨床上測定的不是酶的絕對量而是濃度，1963年并未明確規(guī)定用ml或L表示體積。舊的文獻(xiàn)中可見到mU/ml，或U/L。目前在臨床化學(xué)中，幾乎都習(xí)慣用U/L來表示體液中酶活性濃度。我國由于近年來大量用自動分析儀和連續(xù)監(jiān)測法測酶，已逐步不再使用各種古老單位，而使用U/L來表示酶活性濃度。

近年來國際上大力推廣SI制，我國已明確SI制為法定計量單位制，SI制中酶活性單位為Katal，即1秒中轉(zhuǎn)化1個摩爾底物（mol s^－1）的酶量，Katal對體液中酶量而言顯然過大，常用單位為ukatal或nkatal。

上述國際單位和katal間關(guān)系如下：

1U＝1μmol min^－1＝16.67nmol s^－1＝16.67nkatal

在我國不論實驗室還是臨床醫(yī)師對katal都不太熟悉，如報告使用katal/L報告酶結(jié)果時，最好同時注明相應(yīng)的U/L。

（一）連續(xù)監(jiān)測法中酶活性濃度的計算

前面已提到連續(xù)監(jiān)測法優(yōu)點之一是計算方便，不需作標(biāo)準(zhǔn)曲線或標(biāo)準(zhǔn)管，用分光光度計監(jiān)測酶反應(yīng)過程時，很容易求出反應(yīng)體系每分鐘吸光度變化，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)可求出△A相當(dāng)測定物質(zhì)變化的微摩爾數(shù)，由于臨床醫(yī)師需要知道的是標(biāo)本中而不是反應(yīng)體系中酶的濃度，計算中要考慮標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，假如比色杯光徑不是1cm，則還應(yīng)考慮光徑不同對△A的影響，這樣整個計算公式應(yīng)為：

此中ε為摩爾（線性）吸光體系（mol^－1.L.cm^－1）

△A為吸光度變化

v為標(biāo)本體積（ml）

V為反應(yīng)體系體積（ml）

L為光徑（cm）

在實際測定中后面幾項皆為常數(shù)，所以上式常簡化為：

（二）常數(shù)K的意義和設(shè)置

在測酶時，常數(shù)K值的選擇是很重要的。此值過高雖然測定的線性范圍較寬，但重復(fù)性差，反之，雖然精密度好，但線性窄。

此問題與儀器測定的嗓音（noise）密切相關(guān)，自動分析儀吸光度讀數(shù)嗓音一般都需控制在0.001，也就是儀器須保證對同一溶液反復(fù)進(jìn)行測定時，吸光度誤差最好控制0.001上下，雖然此值不大，但已可能使測定結(jié)果產(chǎn)生1/1000K值的誤差，如K值為6000，代入上式，則每分鐘測定吸光度如有0.001微小變化，結(jié)果將是出現(xiàn)上下6U/L的誤差，對于一此參考值較低的酶，如轉(zhuǎn)氨酶而言顯然太大，臨床醫(yī)師無法容忍這么大差異。

K值設(shè)置的首先出發(fā)點應(yīng)是測定酶的判斷值或參考值上限，應(yīng)保證這些值測定的可靠，所以轉(zhuǎn)氨酶的常數(shù)K一般在3000左右，不少人寧愿在1500左右，另外還應(yīng)考慮到測定時間，一些半自動分析儀測定時間短到0.5分，此時0.001嗓音對每分鐘△A誤差將是0.002，反之，測定時間延長到2分鐘，誤差也小一半，也就是說，如測定時間長，則K值可以設(shè)置大一些，如測定時間只有0.5分鐘，K值一般不超過4000。

改變K值最方便的途徑就是改變標(biāo)本稀釋度，稀釋倍數(shù)愈大，K值愈大。

（三）常數(shù)K值的檢驗

摩爾吸光系數(shù)（ε）對一定物質(zhì)而言常是一個定值，但在一些外界條件影響下也會有所變化。最明顯例子是對硝基酚，隨pH不同，顏色差異明顯，當(dāng)pH＞10時，405nm處其ε為18500，在pH7.0，ε下降為9400，顏色下降幾乎一半。溫度變化時，也會對NAD(P)H的ε產(chǎn)生一些影響。當(dāng)波長大于334nm時，隨溫度升高，同一波長的ε值會輕度下降。

同時ε值是指用分光光度法，也就是在近似單色光的光源條件下才能成立，實際上大多數(shù)自動分析儀使用的是干涉濾片，波峰值可能出現(xiàn)差異，個別的半波寬可能為10nm乃至更大。由于雜散光的存在，會明顯改變ε值，假如再考慮到注加系統(tǒng)的誤差，實測K值很可能與理論K值不一致。Onuki檢測了三臺Hitachi-7150型自動分析儀測AST的K值分別為－5466、－5421、－5559。而理論K值為－6111則結(jié)果約增加為1.12倍。

測定實際的K值不是一件困難的事，目前有些自動分析儀已有相應(yīng)的軟件和試劑可以進(jìn)行檢測。事實上對一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對硝基酚、對硝基苯胺，可以用高純試劑配成標(biāo)準(zhǔn)品或直接購買可靠的校準(zhǔn)品，將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測定，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度變化就可計算出實際K值，但此法不適用于測與NAD(P)H反應(yīng)有關(guān)酶測定的K值。因為NAD(P)H不穩(wěn)定，此時可使用測葡萄糖的紫外分光光度法試劑盒，對已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點法測定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)H，故不難從吸光度變化求出K值，也有人用乳酸脫氫酶測已知量的丙酮酸來求K值。