臨床生物化學/連續監測法中的干擾因素及其控制

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臨床生物化學

血清酶定量的檢測技術
- 測定酶活性濃度的兩大類方法
  - 固定時間法（取樣法）
  - 連續監測法與反應進程的分析
  - 連續監測法測酶活性濃度
  - 酶活性的濃度單位
  - 連續監測法中的干擾因素及其控制

大多數測定標本不是純酶制劑，而是體液或組織液。其中除了測定酶外，還存在著其它酶和各種物質，如使用酶偶聯反應，在反應體系中又外添了大量的各種酶制劑，因此在反應體系中可能出現一些我們不希望的副反應或旁路反應，這些都有可能對測定反應產生干擾。

（一）其它酶和物質的干擾

如組織勻漿中往往含有NADH-細胞色素C 還原酶，它將干擾各種還原酶的測定。臨床酶測定中最典型的例子是血液中丙酮酸對丙氨酸氨基轉移酶測定的干擾，由于反應體系中含有大量乳酸脫氫酶和NADH，可與丙酮酸反應消耗NADH，引起340nm處吸亮度下降，假如將此NADH下降也算為ALT活性將引起誤差。其它如紅細胞中腺苷酸激酶（AK）對CK測定的干擾，在CK的酶偶聯體系中ADP是CK底物，但它又同時是AK的底物，二個酶反應都產生ATP，在工具酶（已糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶）作用下都產生NADH引起340nm處吸光度上升，其結果是CK測定結果偏高，為避免此種干擾，所以在反應體系中加入AK的抑制劑AMP和二腺苷酸5′磷酸。

（二）工具酶的污染

目前試劑中所用的試劑酶多從動物組織或細菌中提取，不可避免地會污染有其它酶，如不注意此問題，會引起不正確結果，例如丙酮酸羧化酶催化下列反應：

可加入蘋果酸脫氫酶和NADH進行測定，將草酰乙酸轉變為蘋果酸，并將NADH轉變為NAP⁺。如果工具酶蘋果酸脫氫酶不純，含有乳酸脫氫酶，也可以作用底物之一的丙酮酸，同時消耗NADH，這樣就無法準確測定丙酮酸羧化酶活性。

更有甚者，有些工具酶中就混有測定酶，這種情況下，將產生很高的本底。

所以所用的工具酶必須很純，并檢查污染酶的含量，例如測定天冬氨酸氨基轉移酶所用的蘋果酸脫氫酶中所含雜的AST時，按IFCC規定不應超過0.005％。

（三）非酶反應

有些底物不穩定，沒有酶的作用就能自行反應，例如ALP的底物磷酸對硝基酚配成的底物溶液，室溫放置過夜，即自行水解釋放出對硝基成黃色。又如測醛縮酶時，其底物醛類化合物可以和NAD⁺起非酶反應產生一種具有類似NADH吸收光譜的化合物，給測定帶來困難。

（四）分析容器的污染

如沖洗不當，分析容器和管道中混雜有各種物質，可能影響酶活性，如微量重金屬可使酶失活，殘留的表面活性劑可能抑制酶活性。

（五）沉淀形成

使用光學法監測酶反應時，如有沉淀形成或組織勻漿中顆粒的下沉都會引起吸光度變化，引起測定結果誤差，此情況常見于底物溶解度低而反應體系中底物濃度偏高。可見于用γ-谷氨酰對硝基苯胺為底物測GGT時。

對上述的一些問題常可通過試劑空白管檢出并加以校正。不同廠家的ALT，AST試劑盒由于雜酶存在，試劑空白管可以測出多少不等轉氨酶活性，個別可達5U/L以上，這種試劑無法使用，較好的試劑盒也在2U/L左右。如不作試劑空白管對結果加以校正，所測結果將偏高，用半自動分析儀測定酶時特別要注意作試劑空白管，有時還需作標本對照管，例如測ALT時為除去GLD的干擾，可以在底物溶液中不加入丙氨酸，與標本中GLD作用引起NADH下降。

解決這些問題另一個有效措施就是不用單一試劑測酶活性，改用雙試劑，先加的第一試劑常不含底物或底物之一，但含有所有其它成分，與標本作用一段時間待吸光度停止變化后，再加入底物開始測定酶的反應。