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臨床生物化學(xué)

血清酶定量的檢測技術(shù) 測定酶活性濃度的兩大類方法 固定時間法（取樣法） 連續(xù)監(jiān)測法與反應(yīng)進(jìn)程的分析 連續(xù)監(jiān)測法測酶活性濃度 酶活性的濃度單位 連續(xù)監(jiān)測法中的干擾因素及其控制

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從這個權(quán)威性的方法分類來看，前面所提到的二類測酶活性濃度方法都應(yīng)歸納為動態(tài)法。目前廣為流行的“動態(tài)法”命名顯然是不確切的或者是不合適的。應(yīng)該更多采用IFCC文件中建議的“連續(xù)監(jiān)測法”命名。

從酶反應(yīng)曲線來比較此二類方法。圖17-7是一個典型酶反應(yīng)過程。

圖17-7　酶促反應(yīng)中基質(zhì)［S］、產(chǎn)物［P］

和反應(yīng)速率V在不同時間變化的模式圖

在酶作用下，底物［S］濃度不斷下降，隨之有相應(yīng)產(chǎn)物［P］產(chǎn)生。不少酶在反應(yīng)一開始的階段，由于各種因素影響，反應(yīng)速度較慢，稱為延滯期，隨后在過量濃度的底物存在條件下，酶反應(yīng)以恒定的速度進(jìn)行，不受底物濃度變化的影響，這段反應(yīng)稱為線性反應(yīng)期或零級反應(yīng)期。隨時間延長，反應(yīng)速度除與酶量有關(guān)，還與底物濃度有關(guān)。即v＝k(a－x)，式中a為原來底物濃度，x為消耗的底物濃度，如反應(yīng)物濃度項上指數(shù)為1，稱為一級反應(yīng)，假如反應(yīng)速率受二種或二種以上物質(zhì)濃度的影響，則各個反應(yīng)物濃度項上指數(shù)總和作為反應(yīng)級數(shù)，可以分別為一級、二級或多級反應(yīng)，總的將這段反應(yīng)時期稱為非線性反應(yīng)期。

很明顯如測反應(yīng)速度的目的是為了從此推算出酶含量的多少，則只有測線性反應(yīng)期的反應(yīng)速度才能作到此點(diǎn)。在延滯期、非線性期測的結(jié)果不準(zhǔn)確，一般是偏低的。

取樣法由于方法學(xué)上的限制，一般只測二管：一為沒發(fā)生酶反應(yīng)的對照管，另一管測酶作用一段時間后反應(yīng)物的變化，實際上測得是平均速度，而且二管間隔時間都較長，在半小時左右，圖17-8中t₀，t分別代表不同時間二管反應(yīng)物的量，雖然從t到t₀反應(yīng)物變化量是相同的。但實際反應(yīng)過程是多種多樣的。

只有當(dāng)反應(yīng)如曲線A時，用“固定時間法”才能測出真實的酶活性，實際工作中是很少見的，圖中曲線B代表了最常見的反應(yīng)情況，在一個很短的線性反應(yīng)期后在大部分測定期間內(nèi)主要為非線性反應(yīng)期。曲線C說明在測定期間包括了延滯期，曲線D則不僅包括了延滯期，還包括非線性期，在這些反應(yīng)中如用固定時間法來測定，結(jié)果是不夠準(zhǔn)確的，一般是偏低的，而且酶濃度愈高，偏離程度愈大。

假如從上節(jié)敘述中得出一個重要結(jié)論：即在設(shè)計和選擇測定酶活性濃度方法時必須是在“最適條件”下測定最大反應(yīng)速度。那么從這段敘述中可得出一個對上述結(jié)論一個很重要的補(bǔ)充，即所測的最大反應(yīng)速度還應(yīng)該是初速度即V₀。

理論上的V₀在實際工作中是不存在的，必須讓酶和底物作用一段時間，消耗掉一定量的底物，才能測出反應(yīng)速度，一般說，如消耗底物在5％內(nèi)所測到的反應(yīng)速度都可認(rèn)為是初速度，如底物濃度很高時，底物消耗在20％以內(nèi)的反應(yīng)往往還在線性反應(yīng)期。

連續(xù)監(jiān)測法能滿足上述重要要求。由于不需停止酶反應(yīng)。很容易得到整個酶反應(yīng)曲線，然后根據(jù)反應(yīng)曲線情況，避開延滯期和非線性反應(yīng)期，只在線性反應(yīng)期測定最大反應(yīng)初速度。同時由于分光光度法的高靈敏度，自動生化分析儀的高精密度，連續(xù)監(jiān)測法能在很短時間，甚至在1分鐘反應(yīng)時間，準(zhǔn)確測定反應(yīng)速度，從而求出準(zhǔn)確的酶活性濃度。“固定時間法”測定時間長達(dá)30分鐘，很難滿足上述方法學(xué)上測定初速度V₀的要求。

圖17-8　二點(diǎn)測定法中可能引起的誤差

從理論上說，只有當(dāng)測定的是初速度，米氏方程式才能成立，并可能測出真正的Km。用“固定時間法”測出的速度受到逆反應(yīng)速度的影響。可以下式表示有逆向反應(yīng)存在時的酶反應(yīng)過程。

k1　k₂　k₃

E＋S→ES→EP→E＋P

←　←　←

K_－1　k_－2　k_－3

存在著EP和P時，就會出現(xiàn)逆反應(yīng)，此時所測的為一表觀速度（Va）或反應(yīng)的凈速度。

Va＝k₂［ES］－k_－2［EP］

［E］t代表酶總量，在反應(yīng)過程中包含了游離酶［E］、酶底物復(fù)合物［ES］和酶產(chǎn)物復(fù)合物［］EP］。

Ks為［ES］的解離常數(shù)，Kp為［EP］的解離常數(shù)，故：

代入上式得：

根據(jù)Maldanc公式Keq＝VfKp/VrKs得：

在反應(yīng)特定時間，產(chǎn)物［P］為一定值，上式得：

此公式從理論上說明，如所測反應(yīng)有逆反應(yīng)存在時，不存在原來的米-門方程式。用各種作圖法很難求出準(zhǔn)確的米氏常數(shù)。如果說所測酶反應(yīng)不僅存在著逆反應(yīng)，產(chǎn)物還抑制了酶反應(yīng)，則動力學(xué)公式將更為復(fù)雜。這就是為什么不僅在建立方法時，就是在研究酶的動力學(xué)時，也總是希望所測量的都是酶反應(yīng)的初速度。

以上這二類方法并不是概括了所有測酶活性濃度的方法，也并不排除在非線性反應(yīng)期測酶活性濃度的可能性。如固定底物變化量，則不同標(biāo)本達(dá)到此變化終點(diǎn)的時間，與酶量成反比例，Somogyi曾提出一種測淀粉酶的方法，酶與底物混合后。每隔半分鐘取一滴出來加入碘液呈色，觀察顏色由紫色變?yōu)榧t色時間，也就是淀粉酶全部水介變?yōu)?a href="/w/%E7%B3%8A%E7%B2%BE" title="糊精">糊精的時間，并由此時間的長短計算出酶含量高低，這類方法不需使用很高濃度的底物，有其獨(dú)特之外，在自動生化分析儀中也曾使用類似的方法，值得人們重視。

固定時間法（取樣法） | 連續(xù)監(jiān)測法測酶活性濃度

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