基礎檢驗學/電阻抗法血細胞分析儀測試原理

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（一）白細胞分析原理

50年代初，庫爾特（W。H。Coulter）發避孕藥并申請了粒子計數技術的設計專利，其理是根據血細胞埋傳導的懷質，以電解質溶液中懸浮的白細胞在通過計數時引起的電阻變化進行檢查為基礎，進行血細胞計數和體積的測定，這種方法稱為電阻抗法，也稱為庫爾特原理（圖2-7）

電阻抗法血細胞計數原理

圖2-7 電阻抗法血細胞計數原理

把用等滲電解質溶液（被稱為稀釋液,diluent）稀釋的細胞懸液侄入一個不導電的容器中，將小孔管插到細胞懸液中。小孔管是電阻抗法細胞計數的一個重要的組成部分，其內側充滿了稀釋液，并有一個內電極，外側細胞懸液中有一個外電極。檢測期間，當電流以接通通后，位于小孔兩側的電極產生穩定的電流。稀釋液通過小孔孔管壁上固有的小孔（直徑一般<100μm.厚度為75μm左右）向小孔內部流動。因為小孔這壁充滿了具有專導性的液體，其電子脈沖是穩定的。如果供給電流I和阻抗Z是穩定的，根據歐姆定期律通過小孔的電壓E也是不變的（這時E=IZ）。當有一個細胞通過小孔時，由于細胞的導電性質比稀釋液要低，在電路中小孔感應區內的電阻的增加，于瞬間能上能下起了電壓變化而出現一個脈沖信號，自然數為通過脈沖。電壓增加的變化的程度取決于非傳導的細胞占據小孔感應區的體積，即細胞體積越大，引起的脈沖越，產生的脈沖振幅越高，脈沖信號經過下列步驟，得出細胞計數結果。

1．放大：由于血細胞通過微孔時產生的脈搏沖訊號非常微弱，不能直接觸發計數電路，因此必須通過電子放大器械，將微伏訊號放大為優級脈沖扭號。

2．甄別：通過微孔時的各種微粒均可產生相應脈沖訊號，訊號電平（脈沖幅度）與微粒在小成正比。因除血細胞外，血中細胞外，血中細胞碎片、稀釋液中雜質微粒均可產生假訊號，使計數結果偏高。所謂甄別就是利用甄別器根據閾值調節器提供的參考電平，將低于參考電平的假訊號去掉，以提高細胞計數的準確性。

3．閾值鹿茸：在一定范圍內調節參考電平的大小，使計數結果可能符合實際。

4．整形：經過放大和甄別后的細胞脈沖訊號波形尚不一致必須經過整形器作用，修整為形伏一致標準的平頂波后，才能觸發電路。

5．計數：血細胞的脈沖信號，經過放大、甄別、整形后，送入計數系統。各型血液分析儀器計數系統甄別方式不同，通過各種方式得出計數結果。（圖2-8）

儀器監測屏上顯示白細胞通過脈沖

圖2-8 儀器監測屏上顯示白細胞通過脈沖

目前很多儀器在給出細胞數據結果之外，是時提供細胞體積分布圖形，這些可以表示出細胞群體分布情況的圖形，稱為細胞分布直方圖（圖2-9）。直方圖是由測量通過感應區的每個細胞脈沖累積得到的，是在計數的同時進行分析測量的。如圖2-8所示，示波器顯示的是所分析的細胞的脈沖大小，圖2-9是相應的體積分布直方圖，橫坐標為體積，縱坐標是血細胞的相對數量，血細胞分析儀在進行細胞分析時將每個細胞的脈沖根據其體積大小分配并存在相應的體積通道中，每個通收集的數據被統計出相對數并表示在“Y”軸上。體積數據以飛機升（fl）為單位，表示在X軸上。

在進行白細胞體積分析時，儀器計算機部分可以將白細胞體積從35-450fl 分為256個通道(channal)，每個通道為1.64fl，細胞根據其大小被分別放在不同的通道中，從而得到白細胞體積分布的地直方圖。（圖2-10）

細胞體積直方圖

圖2-9 細胞體積直方圖

三部法血液分析儀白細胞分布直方圖

圖2-10 三部法血液分析儀白細胞分布直方圖

經過溶血劑處理后的白細胞可以根據體積大小初步確認其相應的細胞群：第一群是小細胞區，主要是淋巴細胞。第二群是單個核細胞區，也被稱為中間細胞（MID），包括單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞，核象左移或白血病可有各階段幼稚細胞及白血病細胞。第三群是大細胞區，主要是中性粒細胞（GRAN）。儀器根據各亞群占總體的比例計算出各亞群的百分率，如果與該標本的白細胞總數相乘，即得到各類細胞的絕對值。可以看出，電阻法只是根據細胞體積的大小，將白細胞分成幾個群體。在一個群體中，可能發某種細胞為主（如小細胞區主要是淋巴細胞），但由于細胞體積間的交叉，可能還有其它細胞的存在。顯然習慣上甩稱的“三分類、”“二分類”血細胞分析儀達個名稱是不夠確切的。國外多采用“三部法”（3-part）或“二部法”(2-part)稱之。國內也有專家建議使用“三分群”或“二分群”描述電阻抗法血細胞分析儀的白細胞分類。

（二）紅細胞測試原理

根據各項參數在血液分析儀檢測原理的不同，檢測大致分為三個部分。

1．紅細胞數和紅細胞比積迄今，絕大多數血液分析儀使用電阻抗法進行紅細胞計數和紅細胞比積測定，其原理同白細胞一樣。紅細胞通過小孔時，形成的相應的脈沖的多少即紅細胞的數目，脈沖的高度代表單個脈沖細胞的體積。脈沖高度疊加經換算即可得到紅細胞的比積（有的儀器先以單個細胞高度計算平均紅細胞容積（MCV），再乘以紅細胞的數得出紅細胞比積。）稀釋的血液進入紅細胞檢測通道時，其中含有白細胞，因此，紅細胞檢測的各項參數均含有白細胞因素，但正常血液有形成分中白細胞比例很少，故其影響可忽略不計，要某種病理情況下，如白血病，白細胞數明顯增加而又伴嚴重貧血時，即可使所得務項參數產生明顯誤差。根據所測單個紅細胞體積及相同體積細胞占總體的比例，可打印出紅細胞體積分布直方圖。

2．血紅蛋白測定：任何類型、檔次的血細胞分析儀，血紅蛋白測定原理是相同的。被稀釋的血液的加入溶血劑后，紅細胞溶解，釋放血紅蛋白，后者與溶血劑結合形成血紅蛋白衍生物，進入血紅蛋白測試系統，在特定波長（一般在530-550nm）下比色，吸光度的變化與液體中Hb含量成比例，儀器便可顯示Hb濃度。不同系列血液分析儀配套溶血劑配方不同，形成的血紅蛋白衍生物亦不同，吸光度各異但最大吸收峰均接近540nm .這是因為ICSH推薦的氰化高鐵法，HICN最大吸收峰在540nm。校正儀器必須以HICN值為標準。大多數系列血液分析儀溶血劑內均含有氰化鉀，與血紅蛋白作用后形成氰化血紅蛋白（注意不是氰化高鐵血紅蛋白），其特點是顯色穩定，最大吸收峰接近540nm，但吸收光譜與HICN有明顯的不同。此點在儀器校正時應十分注意。

為了減少溶血劑的毒性，避免含氰化的血紅蛋白衍生物檢測后的污物處理，近年來，有些血液分析儀使用非氰化溶血劑（如SLS-HB）實驗證明，形成的衍生物與HICN吸收光譜相似，實驗結果的精確性、準確性達到含有氰化物溶血劑同樣水平。既保證了實驗質量又避錫了試劑對分析人員的毒性和環境污染。

3．各項紅細胞指數檢測原理：同一手工法一樣，MCV、平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細胞體積分布寬度（RDW）均是根據儀器檢測，的紅細胞數、紅細胞比積和血紅蛋白量的實驗數據，經內存電腦換算出來的。

RDW由血液分析儀器測量后獲得，是反映外周血紅細胞體積異質性的參數。簡言之，是反映紅細胞大小不等的客觀指標。多數儀器用所測紅細胞體積大小的變異系數來表示，即RDW-CV，也有的儀器采用RDW-SD報告方式。

紅細胞通進小孔的一瞬間，計數電路得到一個相應的大小的脈沖，脈沖的高度是由細胞體積大小決定的，不同大小的脈沖的信號分別貯存在儀器內裝計算機的不同通道內，計算出相應的體積及細胞數后，統計處理而得RDw 值。由于RDw 來自十幾秒內近萬個紅細胞的檢測數據，不但愿可以克服測量紅細胞直徑時人為制片因素和主觀因素等影響，還較P-J曲線更能直接、客觀、及時地反映紅細胞大小不等程度，對貧血的診斷有重要意義。RDW的正常參考范圍見表2-4。

表2-4 RDW正常參考范圍

作者	例數	RDW（<1.64SDX）	報告時間（年）
Bassman	229	<13.9
McClure	90	<14.8	1985
Robert	29	<12.1	1985
Marti	61	<48(RCSDW)	1987
叢玉隆	81（兒童） 70（成年） 60（老年）	<14.6 <14.0 <13.8	1990
叢玉隆等	2013	<14.9	1996

為北京協作組六家醫院使用五種型號全自動血細胞分析儀調查2013例成人（男1013例，女1000例）RDW結果。

（三）血小板分析原理

目前有半自動、全自動兩種血細胞分析儀器儀器的紅細胞計數微孔旁有一股穩定持續的稀釋液流，稱掃洗液體。其流向與孔呈直角，使計數后的流體流走，可防止計數后細胞重新進入循環。計算機還可進行一次校正，即對有多個細胞是時經過通道時，只計一個脈沖數情況的校正。校正指數與計數值多少相關。另釘，用一個脈沖編排器消除中心軸外的顆粒計數及檢測各種細胞經小孔時引起的電阻變化，脈沖經數學化后，數字被送到記憶線路全程，儲存于體積通道中，形成直方圖。血小板計數儲存于64道直方圖范圍為2-20fl。不同儀器血小板直方圖的范圍不一。平均血小板體積就是此平整曲線所含的群體算術平均體積，所以MPV也就是PLT大小分布直方圖的產物。為了使血小板更準確，有些儀器專門設置了增加血小板準確性的技術，如鞘流技術、浮動界標、擬合曲線等。