臨床生物化學/影響光譜分析的主要因素

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臨床生物化學

常用分析技術在臨床生物化學中的應用
- 光譜分析技術的應用
  - 光譜分析技術的分類
  - 光譜分析的常用方法
  - 影響光譜分析的主要因素

臨床生物化學目錄

光譜分析的基礎是被測物質的濃度與吸亮度成正比，但在實際測定中，往往容易發生偏離直線的現象而引入誤差，導致誤差的主要原因有化學因素、主觀因素和光學因素等三類。

（一）化學因素

化學因素是指被測溶液不遵守光吸收定律所引起的誤差。主要有以下幾種影響。

1、被測物濃度的影響由于有色物質的電離、水解、締合等原因，當溶液稀釋或增濃時，有色物質顏色的深淺并不按比例降低或增高，因而也就不完全符合光吸收定律。

2、溶液pH的影響有些溶液的顏色對pH值的改變十分敏感，因而溶液pH不同時常會產生誤差，如溴甲酚綠法測定血清白蛋白。

3、雜質的影響如被測物溶液中含有雜質而且這種雜質本身是有色的，或能和顯色劑生成有色化合物或沉淀，或能與被測物質發生化學反應等，都會影響吸光度的變化。

4、放置時間的影響某些有色物質能迅速生成，但卻不太穩定，放置后色澤消退或起變化，而另一些有色物質須經過相當長的時間后，反應才能完全，因此，若在不恰當的時間內進行比色，將會造成相當大的誤差。

此外，還有溶劑、溫度、溶液體系的均勻性等都會引起測定的誤差。

（二）主觀因素

由于操作不當，特別是在分離、稀釋和加顯色劑等過程中，沒有遵守一定的條件，也會引入不同程度的誤差。因為有些有色物質的生成和其顏色的深淺，往往隨加入試劑的量、加入順序、試劑濃度、反應溫度和反應時間等因素而發生改變。

（三）光學因素

光學因素主要是指分析儀器的性能低劣所引起的誤差，分析儀器應用最多的是分光光度計，它們的性能好壞直接影響到測定結果的可靠性和精密性。因此對分析儀器均應有質量保證措施，這里主要介紹分光光度的質量保證方法。

1、分光光度計的性能檢查

（1）波長校正：使用光電比色計或分光光度計，在更換光源燈、重新安裝、搬運或檢修后，以及儀器工作不正常時，都要進行波長校正。就是正常工作的儀器，每隔一個月也要檢查一次波長，必要時進行校正，這樣才能保證波長讀數與通過樣品的波長符合，保證儀器的最大靈敏度。方法常用譜釹濾光片校正法，適用于721型儀可見光區的波長校正，常以585nm或529nm處的吸收峰或T%為標準。鑒于721型儀器的出射光波長較寬，不易將573nm和585nm的兩峰或兩谷分開，校正時易產生誤差，故推薦用529nm處的峰或谷為標準來進行波長校正。校正時，將儀器按要求預熱。要求電源電壓穩定。波長度盤置580nm處，T%調至最大，在比色杯處放一白紙條，觀察是否有光強均勻、邊緣無光暈或雜光的光斑，如不符合要求，可調節燈泡位置使其符合要求，是為波長校正的粗調。再把靈敏度扭置于“1”（最低檔），波長度盤對準529nm，電表機械零點為零，在光路空白時調T%為100%T，并反復查零點和100%T穩定情況。將譜釹濾光片插入光路，慢慢旋轉波長度盤，找到透光率最低的一點（向左右微旋波長度盤時，該點透光率值均增加），這一點即為波長529nm。檢查波長度盤的指示值是不是529nm，如指示值為534nm，此時波長工誤差為5nm，超出規定（±1nm）必須進行調整。

調整方法：將波長度盤對準529nm，從光路取出譜釹濾光片，光路空白時調電表指針到100%T，再將譜釹濾光片插入光路。打開儀器左側小蓋板，找到波長校正螺絲（3個中左側柄長的一個）；反時針方向微微調節（負誤差時順時針方向），使電表指針的指示T%為最低。反復檢查波長誤差情況，直到符合儀器技術指標為止。蓋好左側小蓋板，校正結束。

有些高檔儀器如島津UV-260型雙光束分光光度計，可使用氫燈或置譜釹濾光片于測定比色槽內，編入濾工掃描程序后，儀器即可自動地在一定波長范圍內進行波長校正。高檔分光光度儀的光學系統密封在一個單元組件內，若發生故障，波長不準，常須請制造商派專人修理。其它尚有譜線校正法、干涉濾光片校正法和有色溶液校正法等，可參考有關資料。

（2）線性檢查：線性檢查包括儀器線性及測定方法線性兩個方面的檢查。線性誤差表現為溶液的濃度與吸光度不成線性關系，出現正偏離或負偏離的現象。這種偏離，按比耳定律的現象來自兩個方面：一是溶液本身不符合比耳定律，這種現象叫做化學偏離；二是儀器本身各種因素的影響，使吸光度測定值與濃度之間不成線性關系，這種現象叫儀器偏離。此處研究的是后者。儀器偏離的因素很多，如雜光、有限帶寬、檢測器噪聲、環境條件變化、波長的變動、比色杯的誤差、輻射光的非平行性、檢測器本身的非線性等。

儀器線性檢查常用一種在一定波長及一定濃度范圍內確知其服從比耳定律的有色物質，配成不同濃度的溶液，來檢查儀器本身是否能如實地反映有色物質的濃度變化。這種檢查方法與任何被測物質呈色反應等方法學上的問題無關。用測得的吸光度對濃度作圖，在理想情況下應是一條直線。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文藍濃度系列來檢查，波長用610nm。

（3）雜光（散光）檢查：在吸光度測定中，凡檢測器感受到的不需要的輻射都稱為雜光。雜光對吸光度測定法的準確性有嚴重的影響，但卻往往被忽視。雜光的來源有：①儀器本身的原因，如單色器的設計、光源的光譜分布、光學原件的老化程度、波帶寬度以及儀器內部的反射及散射等；②室內光線過強而漏入儀器，儀器暗室蓋不嚴；③樣品本身的原因，如樣品有無熒光、樣品的散射能力強弱等。

雜光檢測方法：①紫外光區的雜光監測可用10±0.1g/L的碘化鈉溶液，在240nm處測定的吸光度應大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化鉀溶液，在220nm處測其透光度，即為雜光量，一般應小于1%T。以上測定均用石英杯，以蒸餾水校零。②在可見光區可使用譜釹濾光片或硫酸鎳法檢查。先用譜釹濾片校正波長，然后用黑紙片擋住比色杯光路（進口儀器帶有比色杯樣黑色標柱）之后調整0%T，再用空氣做空白調100%T。插入譜釹濾光片，在585nm處測定，其測定值即為雜光水平。

（4）比色杯的質量檢查：比色杯一般由玻璃、石英或熒石制成，光徑1.0或0.5cm,光線通過時有一部分光為空氣與玻璃接觸面的反射而損失（4%），另一部分（很少）為玻璃吸收。比色杯的質量除其原料外，再就是玻璃的厚度均勻，上下一致，各杯彼此相配。廠家多以四個套供應，且杯口上部外面標有箭頭，箭頭對光源側使用。盡管如此，在使用前還是應作質量檢查。常用伊文藍法：將一定量的2.0mg/L的伊文藍溶液注入比色杯中，比色杯內液面應相等。用一個比色杯作標準，用紅色濾光片（波長600～610nm），用水校零后將此杯的讀數準確調至50%T，接著讀取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范圍內者為合格。

（5）穩定性檢查：檢查方法：將分光光度計及附件接于0.5kVA以上的可調變壓器，先調電壓為220V，波長固定在650nm，在光路比色杯裝以空白液，調讀數為90%T處，再將電壓升至230V及降至190V，觀察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之間為合格。在電源電壓不變的條件下，在3分鐘內其讀數漂移不應超過標尺上限值的±0.5%。

（6）重復性檢查：在波長、工作狀態、電源電壓、比色杯配套等合格的前提下，進行重復檢查。在用交流電源供電時，儀器對一種溶液重復測定的讀數值差應小于或等于標尺上限值的1%。試驗方法：將分析純重絡酸鉀于120～150攝氏度烘干2小時，干燥器中冷卻。精稱509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸餾水溶解并加至刻度，混勻（此液180mg/L鉻）。就用液為30、60、180mg鉻/L。取波長440nm，將應用液各濃度管連續測3～5次，各濃度管中最大誤差小于1%T為合格。

（7）靈敏度檢查：將重鉻酸鉀液配制成30和32.5mg鉻/L及120和122.5mg/L鉻的4種應用液（濃度差兩組各為2.5mg/L鉻）。波長440nm，以水校零點，將上述應用液連續測3次吸光度，兩組2.5mg/L鉻濃度差的吸光度值差都不小于0.01為合格。

2、分光光度計日常工作狀態監測在可見光區范圍內，用一種有色溶液檢查儀器是否處于較好的工作狀態（包括波長、雜光水平等），常用硫酸鎳水溶液。該液在400～700nm之間有吸收峰，峰值在510nm。檢查時，在400、460、510、550及570nm處測定硫酸鎳溶液的透光度值，記錄并保存。待一定時間后用該溶液再檢測。比較前后兩次的數據，即可知儀器的工作狀態。

硫酸鎳溶液的制備：將硫酸鎳溶于0.1%的硫酸中，用量的多少以在510nm測得的透光度達80%T為準，以0.1%硫酸校零點，配好后密封備用。

監測的意義：在400、700nm處的測定可以監測雜光，這些波長處的測定值升高說明雜光增加，其中任一值增加3%就需要進行檢修。510nm處的測定值可以監測帶寬，這個波長的測定值減小說明帶寬加大。光源強度減弱或波長不準可以產生這種結果，如降低2%T，對于帶寬為20nm的儀器就需要修理。460與550nm處的讀數主要作為監測波長之用，稱二次波長校正。這兩個波長的讀數相互關聯，一個升高另一個就降低。如460nm的測定值（透光度）降低，而550nm的測定值升高，說明透過比色杯樣品的波長小于波長度盤指示的波長（圖16-2左）。反之，如460nm的測定值升高，而550的測定值降低，說明透過比色杯樣品的波長大于波長度盤指示的波長（圖16-2右）。

硫酸鎳溶液監測儀器工作狀態

圖16-2 硫酸鎳溶液監測儀器工作狀態

實線代表波長正確時的吸收光譜，虛線代表波長不正確時的吸收光譜。箭頭1表示510nm處的透光度，左右圖均下降；箭頭2表示460nm處的透光度，左圖下降，右圖升高，箭頭3表示550處的透光度，左圖升高，右圖下降。

儀器工作狀態測定后，若波長與雜光符合要求時，記錄并保存各項數據，以備以后測定時對比。一般應每月監測一次，當400nm及700nm處雜光增強時，可能的原因包括：①激發光源陳舊，變黑或表層模糊不清。②透鏡有灰塵。③色散元件失效等。如510nm處透光度減弱，可能原因為光源燈絲故障，比色池出光縫失靈或光柵損壞。