基因診斷與性病/PCR擴增產(chǎn)物的分析法

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基因診斷與性傳播疾病

基因診斷與性傳播疾病
- 基因擴增技術（PCR）
  - PCR的基本原理和基本程序
  - PCR的特點
  - PCR方法
  - PCR反應的基本條件及其對PCR的影響
  - PCR標本的制備
  - PCR實驗中常見問題對策
  - PCR擴增產(chǎn)物的分析法

PCR擴增 DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的，根據(jù)研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產(chǎn)物的大小，有助于擴增產(chǎn)物的鑒定，點雜交除可鑒定擴增產(chǎn)物外，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小，增加檢測的特異性與敏感性，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產(chǎn)物的精確分析。

（一）凝膠電泳分析法

PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，以前者最常用，通過電泳可以判斷擴增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測中，僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解，稍冷后倒入電泳槽。

電泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去離子水漂洗2次，每次min，于UV燈下觀察結果并拍照。

凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小，檢測擴增的情況，還可以用來純化擴增產(chǎn)物。

（二）點雜交

當擴增產(chǎn)物是多條帶時，用點雜交更合適。這種方法的基本過程是，首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上，再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗，用非放射性物質（生物素、熒光素和地高辛等）標記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩(wěn)定性高，使用方便、安全、檢測速度快。

（三）微孔板夾心雜交法

該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后，再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交，漂洗后顯色即可判斷結果，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，因此，其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達5個HBvDNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害，顯色反應類似于臨床常規(guī)應用的ELISA,適于臨床實驗室常規(guī)應用。

（四）PCR-ELISA法

本法避免了電泳和雜交的步驟，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規(guī)PCR擴增特異靶序列。因此，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。