基因診斷與性病/基因診斷技術檢測梅毒螺旋體

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梅毒螺旋體不能進行體外培養。檢測臨床標本中梅毒螺旋體最敏感、可靠的方法是兔感染試驗（RIT），RIT能證實活的梅毒螺旋體存在，是檢測梅毒螺旋體常用的標準方法。然而用RIT對新生兒或成人梅毒進行常規診斷不切合實際。梅毒的血清學診斷對確定感染及治療很有意義，但對早期梅毒診斷不敏感，對先天性及神經性梅毒的診斷不夠特異。血清學試驗用作先天性梅毒的輔助診斷，其首要問題是將無癥狀感染嬰兒從非感染嬰兒區別開來，這些嬰兒的母親梅毒血清試驗陽性，困難在于不能將母親體液免疫反應同嬰兒的抗體反應相區別，因為母親的IgG可傳遞給胎兒。另外由于IgG終身存在，所以很難評價治療結果。血清學診斷常常又存在著假陽性。

PCR檢測梅毒螺旋體DNA，特異性很強，敏感性很高，是目前診斷梅毒螺旋體的先進方法。

（一）PCR引物的設計部位與序列：

目前有四套擴增梅毒螺旋體DNA的系統：擴增47KDa膜抗原基因（tpp47基因），擴增39KDa堿性膜蛋白基因（bmp基因），擴增TpF1蛋白基因（tpf-1）或TyF1蛋白基因（tyf-1）和擴增tmpA基因。

三種擴增系統的引物序列：

47-1CACAATGCTCACTGAGGATAGT648-669

47-2ACGCACAGAACCGAATTCCTTG1284-1035

Tpp47-3　TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC713-734

47-4TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT　 1187-1208

TP3　CAGGTAACGGATGCTGAGT　256-275

TP4　CGTGGCAGTAACCGCAGTCT 762-741

bmpTP5（探針） GACCTGAGGACTCTCAAATC 500-519

TP7　CTCAGCACTGCTGAGCGTAG 172-191

TP8　AACGCCTCCATCGTCACACC　788-769

F1　 CTCTTCAAGGAGCTCAT222-206

Tpf-1F2　 AGACAGTGGTTATGCTc 　 77-61

或tyf-1F3(探針)ATTGCGCCAGCATGTAG　 114-130

F4（探針）ATTGCGCCGGCATGTAG　 114-130

（二）操作方法

1．采集標本，根據病人的情況可采取局部分泌物，抽取淋巴結液，羊水，血清，腦脊液。用適量的蒸餾水稀釋，保存于4℃冰箱。

2．標本處理：目的是為了暴露梅毒螺旋體的DNA，消除標本對PCR的抑制物。采用下列處理方法。

①煮沸法：取10或20μl血清或CSF放入0.5ml微量離心管中，水浴煮10min后在冰浴中冷卻，13000g離心10s，上清用作PCR分析。

②低速離心法：將100μl羊水，血清或腦脊液加入到900μl無菌磷酸緩沖液中，10000g室溫離心10min，上清轉入另外的微量離心管中，20000g4℃離心1h，棄上清，沉淀懸浮于50μl 無菌水中，直接煮沸10min，冰浴冷卻，取40μl上清作PCR。

③堿裂解法：取收集標本100μl加于含1mol/lNaCl,1mol/L NaOH和0.1%SDS的溶液中煮沸1.5min,用400μl（0.5mol/L）Tris-HCl(pH8.0)中和。用相同體積的苯酚抽提，再以100μl 0.15mol/L NaCl抽提苯酚。整個600μl的溶液用相同體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提，然后用相同體積的異丙醇沉淀（-20℃過液）。13000g4℃離心15min，輕輕倒出上清，涼干。沿淀懸浮于51μl無菌水中，取20μl作PCR模板。

（三）PCR擴增

1．擴增47KDa膜抗原基因:100ml反應物含：10mmol/l TrisHCl(pH8.3),50mmol/L KCl，3mmol/LMgCl2,100μg/ml明膠，0.5μg引物(47-1和47-2),75mmol/LdNTPs,2.5u TaqDNA聚合酶。取不同量各種制備的DNA作模板,反應過程:94℃15s，60℃1min,72℃1min,循環40次,末次循環增加72℃10min延伸時間,取10ml反應物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。點雜交分析產物：取10mlPCR擴增產物加入10ml0.5mol/LNaOH-1.5mol/NaCl溶液中變性10min,用380μ11.5mol/l NaCl-1mmol/L Tris(pH7.2)中和,然后用Minifold I點膜,80℃真空處理膜2h,用496bp探針65℃雜交過夜。探針為引物47-3和47-4的PCR產物,用隨機引物法標記.

2．擴增39KDa堿性膜蛋白基因:25μ1反應體系含:1×RT緩沖液,50mmol/lTris-HCl(pH8.5),50mmol/LNaCl,4mmol/LMgCl2,2mmol/L DTT(二硫基蘇糖醇),200μmol/l dNTP,100μmol/L引物(TP7和TP8)，0.01%牛血清白蛋白(無DNase和RNase),1UTaqDNA聚合酶,5μ1樣品,可加入0.05mmol/L四甲胺化氯增強PCR。

PCR1:先用引物TP7和TP8擴增出617bp片段,反應過程:94℃3min后進入循環過程:94℃1min,65℃1min,72℃1min,循環數為30或35,每一循環中72℃延伸遞增5s,最后一次延伸時間延長到6min.

PCR2:再用巢居引物TP3和TP4擴增出500bp片段,PCR1產物用蒸餾水稀釋10倍,取5μ1用作第二次擴增.PCR2中MgCl2和引物濃度分別為5mmol/L和20μmol/L引物(TP3和TP4),其它條件與PCR1相同。

PCR產物分析。①取10μ1反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳；②Southern印跡后,用寡核苷酸探針TP5(以32P作末端標記)雜交。

3．擴增TpF1蛋白基因TyF1蛋白基因:100μ1反應物含:50mmol/l KCl,10mmol/LTris-HCl(pH8.4),2.5mmol/L MgCl2,0.2mg/ml明膠,1μmol/ldNTP,2mmol/L引物(F1和F2),2.5UTaqDNA聚合酶,10μ1經處理的兔睪丸梅毒螺旋體懸液,反應過程:94℃1min,55℃ 1.5min,72℃ 2.5min,循環40次，取10μ1PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳,Southern印跡后,用tpf-1特異的探針F3和tyf-1特異物的探針F4分別雜交。

為使擴增效率達到最大，反應參數應選擇最佳數值。使用大片段雙股DNA探針檢測PCR產物，而不用合成的寡核苷酸探針,因為這樣可通過標記得到較高、特異的放射活性。另外，大片段探針能最大減少野生株tpp47可變序列的假陰性結果及由于Taq DNA聚合酶的錯誤導致堿基替代的假陰性結果。實驗證實：PCR的敏感性確能達到檢測單一tpp47拷貝的水平。

由于臨床標本可能含有大量人細胞和微生物，建立對梅毒螺旋體高度特異的PCR方法是很重要的。盡管大量數椐支持47Da膜抗原基因及其相應基因具梅毒螺旋體特異性，還應深入研究該方法的特異性。在EB染色的瓊脂糖凝膠偶而可見非特異的PCR產物，（如擴增淋病奈氏球菌）時就需要用tpp47特異的探針雜交來增加特異性及敏感性。僅從梅毒螺旋體梅毒亞種和雅司亞種染色體DNA獲得了特異的PCR產物，表明了病原性螺旋體非常相近的親緣關系及47Da免疫蛋白高度保守的抗原性。擴增tpp47不能如常規法那樣能區分梅毒螺旋體和伯氏疏螺旋體，在用血清學試驗診斷梅毒和萊姆疾病時，這兩種螺旋體有交叉反應。

梅毒螺旋體梅毒亞種tpf-1基因在123位置為A，雅司亞種tpf-1基因在123位置為G，Noordhoek用tpf-1或tpf-1特異的寡核苷酸探針（兩種探針僅一個核苷酸不同）檢測不同菌株tpf-1或tpf-1基因的擴增產物。結果表明：不能根據tpf-1或tyf-1基因123位置核苷酸的不同來區別梅毒亞種。這些菌種從梅毒患者分離，一些已用兔傳代多次，通過對新鮮臨床標本中梅毒螺旋體DNA的分析比較，以上結果可能是由于梅毒螺旋體在傳代中點突變所致。