醫學免疫學/抗原或抗體檢測的方法

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醫學免疫學

免疫學檢測法
- 抗原或抗體的檢測
  - 檢測的原理
  - 抗原或抗體檢測的實用意義
  - 抗原或抗體檢測的方法
  - 用標記抗體或抗原進行的抗原、抗體反應

由于各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：

（一）沉淀反應

可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應稱為沉淀反應（precipitation neaction）。

1．環狀沉淀試驗先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉淀環，故名為環狀沉淀試驗（ring precipitationtest）,此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。

2．單向免疫擴散試驗單向免疫擴散試驗（single immunodiffusion）是在凝膠中進行的沉淀反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易于觀察結果，可測定抗原的靈敏度（最低濃度）約為10～20μg/ml，常用于定量測定人或動物血清 IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果（圖20-1）

單向免疫擴散試驗示意圖

圖20-1 單向免疫擴散試驗示意圖

3．免疫比濁法　當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法（immunonephelomytry）就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計（nephelometry）測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4，雙向免疫擴散試驗　雙免疫擴散試驗（double immunodiffusion）是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關性分析（圖20-2）。

雙向免疫擴散試驗示意圖

圖20-2 雙向免疫擴散試驗示意圖

5．對流免疫電泳　對流電泳（counterimmunoelectrophoresis）是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側的孔內加入抗原，于正極側的孔內加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結果。

6．免疫電泳　免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，于槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉淀線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義（圖20-3）。

免疫電泳法基本步示決圖

圖20-3 免疫電泳法基本步示決圖

7．免疫印跡法免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場中根據分子量大小不同病毒抗原各成分散開。第二步，將電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維膜上（電印跡），然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中含有與一種或幾種抗原相對應的抗體的話，則在該抗原印跡部位形成免疫復合物沉淀。在洗去未沉淀的抗原和抗體后，在膜上加標記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復合物發生反應，最后加入顯色底物（如果抗人Ig是用酶標記的）或做放射自顯影（抗人Ig用125Ⅰ標記）以顯示結果（圖20-4）。

免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體

圖20-4 用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體

第一步：經電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離；

第二步：將已分離的抗原經電印跡轉移到硝酸纖維膜上；

第三步：將待檢病人血清加入覆蓋于硝酸纖維膜上；

第四步：加入標記的第二抗體使之覆蓋膜上；

第五步：加入顯色底物（或放射自顯影）顯現第二抗體

（二）凝集反應

細菌、紅細胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖斉c相應抗體結合，抗原與抗體結合形成凝集團塊，即稱為凝集反應（agglutination）。

1．直接凝集　直接凝集（directagglutination）是將細菌或紅細胞與相應抗體結合產生的細菌凝集或紅細胞凝集現象?？捎糜?a href="/w/%E4%BC%A0%E6%9F%93%E7%97%85" title="傳染病">傳染病診斷如肥達氏反應（Widal reaction）診斷傷寒病?；蚶?a href="/index.php?title=%E8%A1%80%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%87%9D%E9%9B%86&action=edit&redlink=1" class="new" title="血細胞凝集（尚未撰寫）" rel="nofollow">血細胞凝集現象檢查血型。

2．間接凝集　間接凝集（indirectagglutination）是用可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細胞表面，與相應抗體混合出現的凝集現象。如用γ球蛋白包乳膠顆粒檢測類風濕關節炎病人血清中的類風濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒用于檢測甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標本中的抗原，如細菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒，一旦與含有相應抗原的腦脊液混合，便可發生凝集，可進行快速診斷。故凝集反應即可測定抗原，也可測抗體，方法簡便、敏感。

3．抗球蛋白試驗抗球蛋白試驗（antiglobulintest,coombs test）的原理為間接凝集試驗。例如應用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時，Rh+紅細胞與抗Rh血清間的反應。因抗Rh抗體是IgG只有兩個結合價，分子較?。ú蝗鏘gM結合價多，分子大）很難直接引起Rh+紅細胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細胞。也就是經抗Ig的作用提高凝集反應的靈敏度。

（三）補體參與抗原抗體反應

這一類反應主要包括溶血反應（hemolytic assay）、補體介導的細胞毒試驗（complement mediated cytotoxicuty test）及補體結合試驗（complement fixation test）。

1．溶血反應　抗體與紅細胞表面抗原相遇，形成紅細胞-抗體復合物即可使加入反應中的補體活化，導致紅細胞溶解，此方法可用于紅細胞的各種抗原或相應抗體的檢測，此法比凝集反應敏感。溶血反應也是用于抗體分泌細胞即空斑形成細胞（PFC）檢測的原理。

2．補體介導的細胞毒試驗各種有核細胞與針對其表面抗原的抗體相遇，所形成的免疫復合物能活化反應中的補體，引起細胞膜穿孔，在一定時間內，細胞仍能維持一定的形態不破碎，加入水溶性染如伊紅Y（eosin Y）或臺盼藍（trypanblue）后，染料即可進入被活化補體穿孔的細胞，不帶相應抗原細胞膜保持完整的活細胞不著色。此方法可用于帶各種抗原的細胞的檢測，如進行細胞MHC抗原的鑒定，和進行淋巴細胞中T細胞總數或其亞類的計數。在一些免疫學實驗中也可用這種方法，根據需要特異地消除帶某種抗原的細胞。

3．補體結合試驗當抗原（可溶性或顆粒性）與相應抗體結合，由于濃度低不出現可見反應時，應用補體結合試驗可檢出此抗原抗體反應，它比凝集反應或沉淀反應靈敏度高。本法包括兩個抗原抗體系統。一為檢測系統由待檢樣品與已知抗原（或抗體）組成；另一為指示系統，由綿羊紅細胞（SRBC）和抗SRBC組成。另加入作為補體的新鮮豚鼠血清。試驗時試管中先加入檢測系統和補體，混合經37℃30分鐘使抗原、抗體、補體形成復合物，再加入指示系統，如出現溶血現象，說明檢測系統中沒有相對應的抗原抗體，補體是游離的指示系統的SRBC和抗體結合而出現溶血，即為反應陰性。如不出現溶血，表明檢測系統中有抗原抗體復合物并結合補體，則指示系統無多余的補體作用而沒有溶血現象，即為陽性。

在敏感的抗原、抗體檢測方法（如酶標方法）出現之前補體結合試驗曾廣泛用于檢測各種細菌、病毒或螺旋體（如梅毒）的抗原或抗體，由于本試驗影響因素多，結果不穩定現已被新檢測方法所代替。