臨床生物化學/核酸擴增技術

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臨床生物化學

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  - 核酸限制性片段長度多態性（RFLP）分析
  - 核酸一級結構（核苷酸序列sequence）分析

通過大腸埃希菌繁殖而增殖重組質粒，也是擴增核酸的手段。但在試管中有效擴增DNA的方法，是在90年代才開展起來的多聚酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）新技術。由于PCR靈敏度高、特異性好、操作方便，在我國發展很快。目前，PCR技術結合分子生物學實驗技術（如逆轉錄反應雜交技術等）開發了許多PCR新技術（reverse transcriptase PCR；PCR-single strandconformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；熱啟動PCR等）。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于點突變分析；二次PCR特異性好，靈敏度高；熱啟動PCR可提高特異性。

PCR技術原理是在了解DNA一級結構基礎上設計引物（primer或sense，人工合成），DNA多聚酶可識別并結合引物，以單鏈DNA為模板，dNTP為底物，合成其互補鏈。通過反復變性，反復合成互補鏈的過程，達到DNA擴增的目的。人的DNA擴增引物長度多為20個核甘酸。（圖18-7）

PCR技術原理

圖18-7　PCR技術原理

PCR反應：DNA樣品0.1-1μg，引物1，2各25-100pmol，dNTP各200μmol/L，Tris-HCl（pH8.3）10mmol/L，KCl 50mmol/L，MgCl₂1.5mmol/L，gelatin（明膠）0.01％，Taq多聚酶2.5-5U，礦物油一滴。93℃7分鐘→50-55℃2分鐘→70-72℃3-1.5分鐘→93℃2分鐘。

將反應物和Marker點樣于凝膠一起電泳，紫外光下觀察結果，拍照保存結果。反應物也可用于印跡（雜交）實驗、多態分析、探針制備等。

注意事項：①DNA樣品純度高，Taq酶（和Klenow酶）有逆轉錄酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②設計的引物分子內（特別3′端）和引物，1，2分子間不形成雙鏈。選擇性好，不增幅目的DNA以外區域的DNA。引物的G+C含量為40％-60％。③dNTP濃度過高易使Taq酶合成錯誤，一般在200μmol/L，有人建議40-50μmol/L。④KCl＞75mmol/L對酶有抑制作用。Mg²⁺濃度過高，NDA不易變性，＞10mmol/L可抑制酶活性40％-50％。⑤多聚酶：Taq多聚酶從嗜熱菌分離得到（1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐熱每經過一次熱變性要補加一次酶），現在經基因克隆的重組體產物Taq酶最適pH8.3～8.8（室溫8.3-8.4），反應溫度75-80℃，95℃以上失活明顯。無3′→5′校讀活性，對SDS敏感（＜0.01％活性也受到抑制，加吐溫－20可抵制SDS抑制）。該酶有逆轉錄酶活性。⑥退火溫度一般設定為Tm－5℃，但實際上與引物一級結構序列有關，設計不當可造成非特異性退火，而造成非特異擴增，此時應調整溫度和相應的時間。⑦循環次數受到的影響因素較多，增加次數可提高靈敏度，但易出現非特異擴增。⑧PCR靈敏高，被檢樣品極易被污染，樣品純化，擴增，檢測區域應分開。房間應經常用紫外光照射。擴增物應定點丟棄，處理。