臨床生物化學/實驗方法的評價

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臨床生物化學

臨床生物化學方法的選擇、建立和評價
- 臨床生化方法學的評價
  - 評價實驗與分析誤差類型的關系
  - 實驗方法的評價

（一）重復性試驗

目的在于考察候選方法的隨機誤差，重復性試驗的方法是對同一材料分成數份試驗樣品，進行多次分析測定。

⒈試驗形式與方法 ①批內重復性試驗：可以用同一份標本在相當短的時間內，按規定的操作方法，在較穩定的條件下，作多次（一般為20次）重復性測定。計算其X、S與CV。不同性質的分析對CV值的要求不同，一般應小于5％，精密的分析或多次平行測定，要求小于2％。②天內重復性試驗：在一天內對一個或數個標本作數批重復測定，其它條件和批內相同，但因在一天內重復測定幾批，所受影響因素要比批內多，所得的CV值可能比批內大一些。③天間重復性試驗：將同一標本每天一次隨機插入常規標本中測定，連續20個工作日，這樣得到的CV值比上述批內與天內大，能反映實際工作的情況。④病人標本的平行雙份測定：如不易得到含有合適基質的穩定樣品（如作血液pH的重復性測定的標本），可采用病人標本的雙份測定來代替重復性試驗，選擇一批病人標本（20至100份），待測物濃度應在實驗方法的分析范圍內，有高有低；記錄標本的特性，如有某種藥物、混濁、溶血或有尿毒癥等，可影響其準確性。可作一批或幾批分析，但每一標本都平行做兩份，用雙份分析結果之差（d）來計算S（∑d/2N）作為不精密度的指標。

⒉分析樣品的選擇作重復性試驗的樣品，應用標準液、控制物溶液、病人標本或混合血清均可，視其用途而定。作批內重復性試驗，用標準液可以得到各種不同濃度，較簡便，它代表了最好的重復性性能。若結果良好，說明方法操作是適宜的，再進一步用其它樣品進行測定。在進行天間重復性試驗時，用凍干質控血清較好，因其穩定、方便。其它樣品進行測定。在進行天間重復性試驗時，用凍干質控血清較好，因其穩定、方便。

⒊分析物濃度的選擇進行重復性試驗時被測物濃度，宜選擇在醫學上具有決定性意義的濃度進行試驗，因為這種濃度在臨床分析實驗結果時最有用處。

（二）回收試驗

所謂回收即分析方法正確測定加入常規分析樣品中的純分析物的能力。目的是測定比例系統誤差，以衡量候選方法的準確度。

⒈方法將被分析的純品標準液加入病人樣品中，成為分析樣品，原病人樣品加入相同量的無分析物的溶液作基礎樣品，然后用實驗方法分析，兩者測定結果的差值為回收量。

⒉回收率計算以測定血清鈣為例說明如下：

⑴樣品制備

1)基礎樣品：血清2ml＋蒸餾水0.1ml；

2)分析樣品：血清2ml＋4mmol/L鈣標準液0.1ml；

3)分析樣品：血清2ml＋25mmol/L鈣標準液0.1ml；

⑵計算公式及計算結果

故本例的②③管的加入量分別為：

回收濃度＝分析樣品測得濃度－基礎樣品測得濃度

回收率（％）＝回收濃度/加入濃度×100％

本例結果見表20-2

表20-2　血清鈣回收試驗結果

測得濃度（mmol/L）	加入濃度（mmol/L）	回收濃度（mmol/L）	回收率％
①1.70	―	―	―
②1.88	0.19	0.18	94.7
③2.85	1.19	1.15	96.6
平均			95.7

理想的結果期望回收率達到100％，現在平均回收率為95.7％，有4.3％的比例誤差，它表明一個含鈣真值為2.5mmol/L的標本，若用該方法測定，約為2.39mmol/L（2.5×95.79％），誤差為0.11mmol/L（2.5×4.3％）。

⒊注意事項

①準確吸量，因為被分析物的理論值是根據加入標準液體積及原樣品的體積計算所得，吸量稍有不準，就會影響結果。因此，選擇經過校準的吸管，嚴格地清洗與干燥，以及按正規要求吸量均很重要。②樣品中加入標準液后，總的濃度必須在測定方法的分析范圍內，一般須作加入高、中、低不同濃度的回收試驗，計算平均回收率。③加入標準液后，最好使實驗樣品中被測濃度達到醫學上具有決定意義的濃度。④加入標準液的體積在整個樣品中要少，一般在10％以內。若稀釋過大，誤差將發生改變，甚至消失。

（三）干擾試驗

干擾試驗的目的也是用來衡量候選方法的準確度的。在加入一定濃度的干擾物的條件下，形成的是恒定系統誤差。干擾物濃度不同，誤差大小也不同。

⒈方法基本與回收試驗一樣，但是加入的是疑有干擾或非特異性反應的物質而不是標準液。以肌酐對葡萄糖測定的干擾試驗方法及結果簡述如下：

樣品制備

1)基礎樣品：0.9ml血清＋0.1ml蒸餾水。

2)分析樣品：0.9ml血清＋0.1ml 442μmol/L肌酐溶液。

3) 分析樣品：0.9ml血清＋0.1ml 884μmol/L肌酐溶液。

所有各樣品均作雙份葡萄糖測定取平均值。加入值的計算同回收試驗。分析樣品與基礎樣品兩值之差為干擾值。結果如下：

葡萄糖測得值	加入肌酐值	干擾值
5.55mmol/L	－	－
5.77mmol/L	442μmol/L	0.22mmol/L
6.16mmol/L	884μmol/L	0.61mmol/L

結果說明：每88.4μmol/L肌酐約使葡萄糖測定增加0.056mmol/L。在正常人，肌酐約為132μmol/L，將使葡萄糖測定帶入約0.11mmol/L的誤差，在臨床上并無意義。但肌酐病理值可達884-1786μmol/L，對葡萄糖測定引入約0.56-1.11mmol/L誤差，就會影響臨床應用。

⒉可疑干擾物的濃度加入可疑干擾物的濃度須達到有價值的范圍，有可能應達到病理標本的最高濃度值，在確證有影響后應測定在何濃度時，產生的誤差在臨床上無意義，即確定使分析結果影響臨床應用價值的最低可疑物濃度值。

⒊被試驗的物質可根據該方法的反應原理，提示出可能的干擾物。一般應考慮的是用膽紅素、溶血（血紅蛋白）、脂血、防腐劑、抗凝劑等進行試驗。但干擾試驗有一定的局限性，因為人們只能試驗某些物質的影響，還有許多藥物和食物成分未經試驗，亦不能認為無關。干擾試驗也可用比較方法進行，比較方法若為常規方法更應如此，若兩個方法具有相同干擾，這種干擾不應作為否定試驗方法的理由，試驗方法應在其它性能方面較原常規方法為好，從而對檢驗質量有所提高。

⒋消除干擾的常用方法 ①作空白（對照）試驗。一是試劑空白，可以校正標本讀數中的試劑部分；另一種是標本空白，用以補償標本中被測物以外的其它物質的影響。②采用各種物理、化學的方法、分離除去干擾物。③近年來出現的由計算機控制的雙波長或多波長檢測儀器，在排除干擾因素方面既有效又簡便（詳見儀器分析有關內容）。

（四）方法比較實驗

對比試驗用于檢測候選方法的系統分析誤差，包括比例和恒定兩種系統誤差在內。如果對適當的數據進行分析，也可提供系統誤差的性質究竟是屬恒定誤差還是比例誤差。

⒈方法對一組病人的標本用候選方法和對比方法同時進行分析測定，最后觀察兩者之間的差異。這是考驗候選方法是否可被采用的重要措施。

⒉比較方法的選擇在臨床生化常規方法評價時，最好選擇參考方法作為對比方法。這樣在解釋結果時，就可把方法間的任何分析誤差都可歸于候選方法。

⒊注意事項 ①試驗樣品數：一般作40-100例，包括各種疾病的樣品，即包括在常規工作中可能遇到的整個分析范圍。選擇合適的樣品比增加試驗樣品的數目更為重要。②重復分析：一般每個樣品用兩種方法各測定一次，最好各測定兩次，不是平行測定，而是分兩批進行。兩種方法及兩批測定，須在同一天內，最好是在4小時內進行。③時間間隔：每天測定2-5個樣品，約測定20天。④結果的圖示：根據實驗結果作坐標圖，比較方法所得數值為橫坐標，候選方法所得數值為縱坐標，用以定性地估計分析誤差。進行雙份測定時，候選方法的第一次結果與對比方法的第一次結果作圖；第二次結果也如此。溶血、脂血、黃疸標本，可在相應的散點上標以H、L、I等符號。每天測定的結果應及時繪于圖上，以便及時檢查結果，發現問題，對結果有矛盾的樣品，可取原樣重新測定。

⒋統計處理方法比較試驗所得的結果是配對資料，可進行配對資料的統計處理，包括配對t檢驗、相關和回歸分析等。通常都選用相關回歸分析方法，因為此法可以計算出所研究濃度范圍內任一濃度的系統誤差。從回歸方程y＝a＋bx中，可顯示出候選方法有無系統性誤差。這種誤差分類：恒定系統誤差與比例系統誤差，或兩者兼有。回歸線的截距a代表恒定誤差，回歸系數（回歸線的斜率）b代表比例誤差，相關系數r代表兩種方法的相關性是否密切。

實際情況并不簡單，X與Y值都有偶然誤差存在，b與a只是估計值，需要確定其可信限。在評價一種候選方法時，如果a＝0，b的數值稍偏離1.0，那么這種偏離程度是否小到可以忽略不計，因而使候選方法可以接受。這就需要參考a及b值的變動范圍，根據經驗判斷是否可以適用于臨床檢驗的目的。在方法比較試驗中的相關系數r可作為候選方法可否接受的一種指針，但r值隨病人標本測定范圍的增加而增大，因此，在配對資料分析中，不應片面地根據相關系數r來判斷兩種方法分析結果的符合程度。