引物
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引物，是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時(shí)，作為每個(gè)核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。
類型
存在有自然中生物的DNA復(fù)制引物（RNA引物）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中人工合成的引物（通常為
DNA引物）。一般所說(shuō)引物，指DNA引物，以下簡(jiǎn)稱引物。
引物設(shè)計(jì)原則
引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。
在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。
PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地擴(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。
1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。
DNA序列的保守區(qū)是通過(guò)物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過(guò)序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。
2.引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間。
引物長(zhǎng)度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。
4.引物3′端要避開(kāi)密碼子的第3位。
如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。
5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。
引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T(mén)時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。
6. 堿基要隨機(jī)分布。
引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在GC富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。
7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。
兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′ 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過(guò)高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。
8. 引物5′ 端和中間△G值應(yīng)該相對(duì)較高，而3′ 端△G值較低。
△G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，△G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′ 端和中間△G值相對(duì)較高，而3′ 端△G值較低（絕對(duì)值不超過(guò)9）的引物。引物3′ 端的△G 值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的△G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析）
9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。
引物的5′ 端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。
引物的延伸是從3′ 端開(kāi)始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。
10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
某些引物無(wú)效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。
11. 引物應(yīng)具有特異性。
引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST檢測(cè)。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。
值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
做Real Time時(shí),用于SYBR Green I法時(shí)的一對(duì)引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計(jì)上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計(jì)的要求：
●避免重復(fù)堿基，尤其是G.
●Tm=58-60度。
●GC=30-80%.
●3'端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C.
●正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。
●PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80～150 bp最為合適（可以延長(zhǎng)至300 bp）。
●引物的退火溫度要高，一般要在60度以上；
要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。
而且引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。
做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對(duì)于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個(gè)能用的引物的思想準(zhǔn)備---尋找合適的引物非常不容易。
關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過(guò)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個(gè)引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開(kāi)的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒(méi)有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個(gè)引物的特異性就很差，從而不能用。
常用引物設(shè)計(jì)軟件
■Oligo 6
Oligo 6是目前使用最為廣泛的一款引物設(shè)計(jì)軟件，除了可以簡(jiǎn)單快捷地完成各種引物和探針的設(shè)計(jì)與分析外，還具有很多其
他同類軟件所不具有的高級(jí)功能：
● 已知一個(gè)PCR引物的序列，搜尋和設(shè)計(jì)另一個(gè)引物的序列；
●按照不同的物種對(duì)MM子的偏好性設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物；
● 對(duì)環(huán)型DNA片段，設(shè)計(jì)反向PCR引物；
●設(shè)計(jì)多重PCR引物；
●為L(zhǎng)CR反應(yīng)設(shè)計(jì)探針，以檢測(cè)某個(gè)突變是否出現(xiàn)；
●分析和評(píng)價(jià)用其他途徑設(shè)計(jì)的引物是否合理；
●同源序列查找，并根據(jù)同源區(qū)設(shè)計(jì)引物；
●增強(qiáng)了的引物/探針?biāo)褜な侄巍ＴO(shè)計(jì)引物過(guò)程中，可以"Lock"每個(gè)參數(shù)，如Tm值范圍和引物3’端的穩(wěn)定性等；
● 以多種形式存儲(chǔ)結(jié)果；支持多用戶，每個(gè)用戶可保存自己的特殊設(shè)置。
■Primer Premier 5.0
Primer Premier 5.0 是一種用來(lái)幫助研究人員設(shè)計(jì)最適合引物的應(yīng)用軟件利用它的高級(jí)引物搜索引物數(shù)據(jù)庫(kù)巢式引物設(shè)計(jì)引
物編輯和分析等功能可以設(shè)計(jì)出有高效擴(kuò)增能力的理想引物也可以設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)50kb以上的PCR產(chǎn)物的引物序列。
該軟件主要由GeneTank 序列編輯，Primer 引物設(shè)計(jì)，Align 序列比較，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等幾個(gè)主要功能板塊組成。
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